Культура ізольованих клітин і тканин

Об’єктом культури in vitro можуть бути різні тканини, взяті із різних частин рослини. Найчастіше в ізольованій культурі вирощують прокамбіальні тканини, що містять первинний і вторинний камбій, судинну паренхіму коренеплодів і бульб. Останнім часом особливого значення набуло культивування тканин лікарських рослин (серед них раувольфія, діхроа, женьшень, діоскорея).

При культивуванні рослинних тканин перевага надається тканинам стебла і це не випадково: тканини стебла легко утворюють калюс, крім цього з них значно легше отримати стерильну культуру. Крім того тканини кореня, бульб, цибулин більш інфіковані, і отримати з них стерильну культуру складніше.

Культура експлантатів корене- і бульбоплодів і серцевини стебла використовується для дослідження індукції клітинних поділів і первинних етапів диференціації. У цьому випадку клітини, які перебувають на кінцевій стадії диференціації, під впливом ауксинів та цитокінінів в умовах культури in vitro переходять в дедиференційований стан і поновляють меристематичну активність. А у дедиференціаційованих тканин можна викликати диференціацію на рівні гістогенезу та органогенезу.

Експлантати серцевини тютюну. Для індукції клітинних поділів у серцевинній паренхімі тютюну потрібні і ауксин, і цитокінін. Тому цю тканину використовують для визначення ролі кожного із гормонів в індукуванні поділів. У культурі тканини, отриманої із серцевини паренхіми тютюну, можна індукувати утворення меристем стеблового апекса і отримати рослини-регенеранти. Тобто, експлантати серцевини тютюну можна використовувати для вивчення метаболізму клітини при проходженні нею циклу від спеціалізованої тканини стебла до тканини стебла рослини-регенеранта.

Крім цього, експлантати серцевини стебла тютюну використовують для дослідження в них індукції елементів провідної системи – трахей.

Ріст експлантатів, взятих із різних ділянок стебла, сильно відрізняється. Тому для вичленення експлантатів серцевини стебла тютюну використовують друге або третє міжвузля. Рослини тютюну повинні бути у фазі бутонізації – до цвітіння.

Експлантати культивують на твердому або рідкому середовищі, дотримуючись умов фізіологічної полярності – апікальним кінцем вниз.

Експлантати бульб і коренеплодів. Для роботи відбирають здорові, не пошкоджені шкідниками коренеплоди і бульби. Однорідність клітинного складу, синхронність поділу, чітка відповідь на вплив індукторів поділу роблять експлантати бульб і коренеплодів зручною системою для вивчення метаболізму клітини при проходженні нею клітинного циклу і переходу із диференційованого стану в дедиференційований. Цю модель використовують для вивчення індукції синтезу ДНК, білка і різних форм РНК, дослідження ферментативної активності в різні фази клітинного циклу. Бульби топінамбура складаються із сильно вакуолізованих клітин запасаючої паренхіми. При посадці експлантатів бульби на середовище з ауксином (2,4–Д або ІОК) індукуються клітинні поділи з досить високим рівнем синхронності, так як клітини бульби топінамбура, що перебувають у стані спокою, знаходяться в G₁–фазі і при поміщенні в умови in vitro синхронно проходять послідуючі фази клітинного циклу.

Інтенсивність росту шматочка тканини на живильному середовищі залежить від індивідуальних особливостей бульби або кореня і звичайно варіює між коренями навіть в межах одного сорту. Ріст тканини залежить також від положення експлантата по довжині коренеплоду: звичайно, тканини, які вичленені із верхньої третини коренеплоду, ростуть краще.

Експлантати культивують на твердому або рідкому середовищах. Щодо фізіологічної полярності, то експлантати коренеплодів моркви поміщають на середовище апікальною стороною донизу. В той же час для експлантатів бульб топінамбура або картоплі дотримання умов полярності не обов’язкове, а для того, щоб повністю виключити її вплив, можна поміщати експлантат на середовище тангентально. Хоча є думка, що дотримання умов полярності залежить від розмірів експлантатів: для досить великих експлантатів – важливо дотримуватись умов полярності, а для дуже маленьких – не обов’язково.

Культура тканин пагонів деревних порід використовується в основному для прискореного розмноження. Для цього використовують калюсні і клітинні культури. Особливого значення цей метод має для хвойних порід, а також тих деревних, які важко вкорінюються і прищіплюються звичайним способом.

Перед введенням в культуру пагони спочатку стерилізують. Встановлено, що зберігання пагонів довжиною 10–20 см впродовж кількох днів перед посадкою загорнутими у вологу ганчірку у холодильнику знижує пошкодження тканин пагона стерилізуючими речовинами в результаті закупорювання провідних елементів підсихаючим соком.

Для отримання калюсу з хорошим ростом краще використовувати молодші частини пагона або пагони молодих рослин. У деяких випадках (наприклад у Coffea sp.) здатність утворювати калюси властива лише молодим зеленим пагонам.

Утворення калюсу, хоч і в різній мірі, відмічено у всіх тканин пагона (камбію, лубу, деревини, серцевини). Дослідники спостерігали проліферацію високо спеціалізованих клітин смоляних ходів при культивуванні фрагментів із 3–5 річних гілок 14 видів сосни.

Однак найчастіше використовують фрагменти стебла, які містять камбій, що обумовлене високим вмістом ендогенних цитокінінів у таких експлантатах, і їх високою регенераційною здатністю. Камбіальні експлантати деяких видів деревних рослин можуть утворювати калюс не тільки на середовищі без цитокінінів, але ауксинів, вітамінів та амінокислот. Калюсоутворення на середовищі, що містить тільки мінеральні солі і вуглеводи (сахарозу або глюкозу) спостерігали на фрагментах пагонів каштана (Castanea) і берези, на середовищі без ауксинів – у пагонів плюща і маслини.

Встановлено, що інтенсивність калюсоутворення у пагонів деревних залежить від сезону. На експлантатах каштана калюсоутворення інтенсивніше відбувається весною, у сосни – на експлантатах ізольованих літом, у персика – в травні, червні. У листопадних порід максимальну проліферацію у фрагментів виявлено протягом жовтня – травня, тоді як процес калюсоутворення на експлантатах вічнозелених рослин мало змінювався протягом року.

Калюс камбіального походження ряду сортів і видів яблуні і вишні утворюється незалежно від пори року, тоді як розвиток паренхімного калюсу пов’язаний з сезоном.

Основний напрямок досліджень в області культури тканин деревних – це вивчення впливу різних факторів середовища на калюсоутворення та індукцію морфогенезу у цих калюсів. Для утворення калюсу на експлантатах пагонів деревних рослин у більшості випадків потрібні підвищені концентрації ауксинів – 2,4–Д, НОК, ІОК (2–10 ^мг/_л). Здатність до калюсоутворення різна у різних тканин одного виду, а також різних видів. Сама низька регенераційна здатність у хвойних.

Індукція морфогенезу залежить від певного співвідношення ауксинів і цитокінінів, досить часто використовують суміш кінетину і БАП. Але шляхом морфогенезу у калюсній або суспензійній культурах отримано незначну кількість рослин-регенерантів листяних порід, а для хвойних порід такі відомості відсутні.

Для розмноження тих видів деревних, із тканин пагонів яких не вдається регенерувати рослин, доцільно використовувати експлантати із інших органів (пилок, зародки, проростки, меристеми).