Культура калюсних тканин

Калюс – тканина, що виникла в результаті неорганізованої проліферації клітин органів рослин.

У природі калюс утворюється в результаті дедиференціації паренхімних клітин у відповідь на поранення. Утворення і ріст калюсу регулюються ауксинами і цитокінінами. За допомогою цих речовин можна індукувати утворення калюсу у тих тканин рослини, які не утворюють його у відповідь на поранення. Існують нові уявлення, згідно яких не ауксини і цитокініни, а полісахариди та якісь інші індуктори викликають ділення клітин, в результаті якого утворюється калюс.

Перехід клітини in vitro із диференційованого стану до дедиференціації і активних клітинних поділів обумовлений зміною активності генів (епігенетичною мінливістю). Активування одних генів і репресування інших приводить до зміни білкового складу клітин. В калюсних клітинах з’являються специфічні білки і водночас зникають або зменшуються в кількості білки, які характерні для фотосинтезуючих клітин листка.

При переході дедиференційованої клітини до неорганізованого анархічного розмноження, яке приводить до утворення калюсної тканини, в клітинах відбуваються біохімічні і цитологічні зміни. Дедиференціація починається з використання запасних речовин і руйнування спеціалізованих клітинних органел. Через 6-12 год після індукції дедиференціації клітинна стінка розпушується і розбухає, збільшується кількість вільних рибосом, зростає кількість елементів апарату Гольджі, збільшуються розміри і кількість ядерець. Всі ці зміни передують початку поділів, які починаються через 48-72 год.

Після індукування утворення калюсу в асептичних умовах його відділяють і поміщають на поверхню агарового живильного середовища. В результаті цього отримують стерильну калюсну культуру або тканину, яка є основним типом рослинної тканини, що культивується. Вперше калюс був отриманий із кореня моркви Р.Готре у 1938 році.

На сьогодні калюсні культури індукуються практично із будь-якого органа і тканини рослин (листків, стебел, коренів, квітконосів, частин квітки) і навіть таких спеціалізованих тканин рослин, як ендосперм насіння або мікроспори ізольовані із пиляків. Однак простота цього процесу залежить від виду рослини і тканини. Здатність утворювати калюс в умовах in vitro у молодих, ювенільних, рослин вища, ніж у зрілих. У випадку спеціалізованих тканин, наприклад ендосперму, утворення і ріст калюсу залежать від віку насіння. Як правило, калюс погано утворюється на експлантатах старших 8-11 діб після запилення. Відрізки стебла деревних рослин звичайно є поганими експлантатами для отримання калюсу.

Варто зазначити, що для успішної ініціації первинного калюсу в живильне середовище часто необхідно додавати антиоксиданти (глютатіон – 5 мг/л, діетилдитіокарбамат – 5, цистеїн – 5, аскорбінову кислоту – 5, полівінілпіролідон – 250-500 мг/л та інші), які будуть інгібувати ферменти, що окислюють феноли. Продукти окислення фенолів токсичні і пригнічують поділ клітин експлантата.

При отриманні первинного калюсу експлантати краще культивувати на кількох середовищах з різним співвідношенням ауксинів:цитокінінів (табл. 4). Успіх отримання калюсу у значній мірі залежить від підбору регуляторів росту, індукторів клітинного поділу.

Із ауксинів найчастіше використовують 2,4–Д або ІОК, яка має меншу активність. Для індукування калюсогенезу співвідношення ауксинів до цитокінінів у живильному середовищі повинно бути 10:1.

Для отримання калюсу клітини спеціалізованих тканин при поміщенні на живильне середовище повинні дедиференціюватися. У більшості випадків клітини переходять до спеціалізації із фази G₁, яка передує S-фазі – фазі синтезу ДНК, рідше із фази G₂. Досить часто експлантат, який використовують для отримання калюсу, містить тканини, клітини яких по різному диференційовані. Різне тканинне походження первинних калюсних клітин є однією з причин гетерогенності калюсної тканини, так як деякі функціональні особливості диференційованих клітин передаються у ряді клітинних поколінь, як стійкі модифікації. Однорідність вихідної тканини має особливе значення для злаків.

У дводольних рослин калюси легко утворюються на експлантатах різних органів: із насіння, що проростає в асептичних умовах, сегментів стебла і коренів, ізольованих фрагментів паренхіми бульб, ізольованої серцевини стебла, із листка, органів квітки, зародків, плодів і т.д.

Для отримання калюсу голонасінних доцільно використовувати, як вихідний матеріал, бруньки, які ростуть, стерильні проростки, фрагменти флоеми. Калюси злаків отримують із зародків, мезокотилів, коренів або відрізків основи стебла. Основна проблема отримання калюсу злаків пов’язана із складністю виділення із цих рослин експлантату, який складається із однорідної тканини і має оптимальний, достатній розмір. Перша калюсна культура злакових отримана із ендосперму кукурудзи у 1949 році.

На сьогодні розроблені умови отримання калюсу ряду злакових культур. Так, калюс жита отримали із ізольованого кореня, калюс ячменю – із зародка, а суспензійну культуру – із відрізків кореня проростків, калюс риса – із вузлів стебла, відрізків коренів, пагонів, вівса – із насіння, що проростає, пшениці – із сім’ядольних вузлів і зародка.

Основною особливістю середовищ для калюсогенезу у злаків і подальшого культивування калюсу є високий вміст ауксинів, найчастіше 2,4–Д (до 10 ^мг/_л). ІОК звичайно використовують у вищій концентрації, ніж її синтетичний аналог.

Таблиця 4

Склад середовищ для вирощування калюсних тканин рослин

Компоненти середовища	Основне середовище, мг/л
Гамборга та Евелега	Мурасиге і Скуга	Ніча та Ніч	Шенка і Хільде-брандта	Уайта
NH4H2PO4
NH4NO3
KNO3
CaCl2×2H2O
Ca(NO3)2 безводний					208,50
MgSO4×7H2O
KH2PO4
KCl
NaH2PO4×2H2O	169,6				18,7
(NH4)2SO4
Na2SO4
FeSO4×7H2O	28,0	27,8	27,8	15,0
Na2EDTA.2H2O	37,3	37,3	37,3	20,0
H3BO3	3,0	6,2	10,0	5,0	1,5
ZnSO4×7H2O	2,0	8,6	10,0	1,0	3,0
CuSO4×5H2O	0,025	0,025	0,025	0,2	0,001
CoCl2×6H2O	0,025	0,025		0,1
KI	0,75	0,83		1,0	0,75
Na2MoO4×2H2O	0,25	0,25	0,25	0,1	0,0025
MnSO4×4H2O	13,2	22,3	25,0	13,2	7,0
Мезоінозит	100,0	100,0	100,0	1000,0
Гліцин		2,0	2,0		3,0
PP	1,0	0,50	5,0	5,0	0,5
Фолієва кислота			0,5
Біотин			0,05
В1	10,0	0,10	0,5	5,0	0,1
В6	1,0	0,5	0,5	0,5	0,1
ІОК		0,2
2,4-Д	2,0			0,5
Кінетин		0,2
Сахароза
Агар
pH	5,6-5,8

Оптимальна концентрація ІОК для злаків досягає 100 ^мг/_л. Виключенням є калюс ендосперму кукурудзи, який росте на середовищі без ауксинів, так як здатний їх синтезувати.

Процес калюсоутворення залежить від розмірів експлантата – звичайно це 5–10 мм³. Для багатьох експлантатів обов’язково дотримуватись фізіологічної полярності.

Калюси можна вирощувати дуже довго. Для цього необхідно кожні 3-4 тижні пересаджувати частину утворених клітин на свіже живильне середовище. “Найстарішим” вважають штам клітин, одержаний з коренеплоду моркви Роже Готре ще у 1938 році, який і сьогодні вирощують у багатьох лабораторіях світу.

У циклі вирощування калюсні клітини після ряду поділів проходять звичайний для рослинної клітини онтогенез, вони переходять до росту розтягуванням, потім диференціюються як зрілі калюсні клітини і нарешті відмирають.

Калюсна тканина представляє аморфну масу тонкостінних паренхімних клітин. Колір маси може бути білим, жовтуватим, зеленим, червоним.

Залежно від походження і умов вирощування калюсні тканини бувають:

1) пухкими, сильно оводненими, розсипчастими;

2) середньої щільності, або компактними із меристематичними зонами;

3) щільними.

Консистенція калюсу залежить, в значній мірі, від складу середовища: на середовищах з ауксинами, особливо з 2,4–Д, калюси стають пухкішими. Із пухких калюсів дуже легко отримати суспензійну культуру при поміщенні їх у рідке середовище. Із компактних калюсів можна отримати пухкі, але не навпаки. Найбільша здатність до морфогенезу характерна для компактних калюсів, які повільно ростуть.

Пухкі і щільні калюси відрізняються анатомічно: щільні калюси менш диференційовані, містять багато вакуолізованих клітин, які щільно упаковані. Крім цього у щільних калюсів загальна кількість полісахаридів клітинної стінки вища, але вміст целюлози порівнюючи з пектиновими речовинами і геміцелюлозами занижений.

Калюсні тканини використовують для збереження у ростучому стані колекцій різних штамів, ліній, мутантів, із них отримують клітинні суспензії, які культивують в рідкому живильному середовищі, для регенерації рослин.

Особливості калюсних клітин

Калюсні клітини in vitro зберігають багато фізіолого-біохімічних рис властивих нормальним клітинам, які входять до складу рослинного організму. Калюсні клітини зберігають здатність до синтезу вторинних метаболітів. Калюсам, які отримані від морозостійких рослин, притаманні морозостійкість і здатність до загартування. Такої властивості не мають калюси і тканини тропічних і субтропічних рослин. Отже, стійкість до низьких температур зберігається при переході клітини до калюсного росту.

Спільним у калюсних і нормальних клітин також є стійкість до дії високих температур, осмотично активних речовин, засолення.

Поряд з тим калюсні клітини можуть набувати деяких властивостей, які відрізняють їх від материнських. У них з’являються специфічні білки і зменшується кількість білків, які властиві фотосинтезуючим клітинам листка, або вони зовсім зникають. Калюсні клітини відрізняються значною генетичною гетерогенністю та фізіологічною асинхронністю.

В результаті виходу з під контролю організму калюсні клітини ростуть неорганізовано і асинхронно.

Клітинний цикл калюсних клітин довший, ніж у материнських клітин. Особливістю калюсних клітин є гетерогенність за віком. В калюсній тканині одночасно присутні клітини молоді в G₁-фазі, старі в G₂- і S-фазах циклу.

Значні відмінності спостерігаються в енергетичному обміні калюсних клітин. Вони споживають менше кисню у порівнянні з нормальними. Дихальний коефіцієнт калюсних клітин більший 1, що свідчить про зсув співвідношення між диханням і бродінням в бік посилення бродіння. Мітохондрії в калюсних клітинах розвинуті слабо, у них мало крист, що не може не впливати на активність аеробного дихання.

В калюсних клітинах спостерігається зсув в сторону пентозофосфатного шляху, який є джерелом пентоз, необхідних для клітин, що діляться.

Генетика калюсних клітин

Тривалий час вважали, що калюсні клітини генетично однорідні. Однак в 60-х роках ХХ ст. було виявлено, що калюсні тканини мають виражену генетичну гетерогенність.

Однією з причин генетичної нестабільності клітин, що культивуються in vitro може бути генетична неоднорідність вихідного матеріалу (гетерогенність експлантата). У багатьох рослин диференційовані тканини містять клітини різної плоїдності. Другою причиною може бути тривале культивування культур in vitro, яке призводить до накопичення в них генетичних змін, в тому числі до нерівномірної зміни плоїдності. Порушення кореляційних зв’язків при ізолюванні ділянок тканин рослин і поміщення їх на штучне живильне середовище теж призводить до генетичної нестабільності клітин. Подібні результати можуть бути обумовлені впливом на генетичний апарат клітини фітогормонів, які входять до складу живильних середовищ. Найактивнішим мутагеном є 2,4-Д, яка є складовою більшості живильних середовищ. Цитокініни, зокрема кінетин, сприяють поліплоїдизації клітин.

Генетичне різноманіття калюсних клітин дозволяє використовувати їх для клітинної селекції на стійкість до несприятливих факторів середовища, фітопатогенів і на підвищену продуктивність.