Культура ізольованих органів і зародків

Культура ізольованих коренів є зручним методом для вивчення впливу зовнішніх факторів, компонентів живильного середовища (макро- і мікроелементів, вуглеводів, фізіологічно активних речовин), токсичних елементів на їх ріст, для вивчення синтетичних функцій кореня, а також механізмів біосинтезу окремих речовин. Видільна функція коренів, яка проявляється у культурі, може бути використана для вивчення процесів взаємовпливу між коренями різних видів рослин, коренями і бульбочковими бактеріями, мікоризними грибами, бактеріями при спільному культивуванні.

Перші роботи по культивуванню ізольованих коренів були проведені Коте і Роббінсом у 1922 році. Тривалого культивування ізольованих коренів добився Уайт, а запропоноване ним у 1934 році середовище для культивування ізольованих коренів використовується і сьогодні.

Відносно невелика кількість видів рослин досліджена на здатність їхніх коренів рости в ізольованій культурі. Із класу голонасінних найбільше вивчені умови росту ізольованих коренів деяких видів сосни. Із інших деревних порід в ізольованій культурі успішно ростуть корені шовковиці, акації, ялини європейської, берези пухнастої, дуба черешчатого. До цього часу не вдалося виростити в безперервній культурі корені однодольних, за виключенням пшениці та жита.

В ізольованій культурі вирощують відрізки кінчиків коренів проростків, зародків непророслого насіння, адвентивні корені, що утворилися із калюсних культур, ділянки кореневих систем рослин. У останньому випадку корені невеликого діаметра спочатку стерилізують, а потім переносять в живильне середовище. Однак, так як тканини кореня легко пошкоджуються стерилізуючими сполуками, то загальноприйнятим способом є отримання коренів від проростків із простерилізованого насіння, вирощених в асептичних умовах.

Найчастіше ізольовані корені культивують на рідкому живильному середовищі у колбах об’ємом 100 мл, в які наливають 50 мл середовища.

Важливе значення для нормального росту ізольованих коренів має температурний фактор, бо температура впливає на процеси клітинного поділу і росту розтягуванням. Для більшості коренів дводольних оптимальна температура в умовах in vitro становить 25°–27° С, а для коренів голонасінних – 18° – 20° С.

Іноді виникає потреба тривалого збереження культури коренів без пересадки. В таких випадках ватні пробки культуральних посудин обгортають тонкою поліетиленовою плівкою для зменшення випаровування середовища і поміщають у холодне приміщення з температурою 4°–5° С.

Корені томатів і люцерни при цій температурі зберігали свою життєздатність 7–10 місяців.

Як правило ізольовані корені вирощують у темряві. Світло впливає на них тільки під час пересадок. Але у ряді робіт показано значний вплив світла різної інтенсивності і різного спектрального складу на ріст і процеси обміну у коренях. Так, освітлення білим світлом у дослідах з коренями томатів стимулювало ріст головного кореня і інгібувало ріст бічних. Освітлення коренів сприяє синтезу в них ауксину. У дослідах з коренями люцерни та гірчиці білої встановлено, що синє світло сильніше інгібувало ріст, ніж червоне, проте під його впливом посилювався синтез аскорбінової кислоти і підвищувалась активність ІОК-оксидази. Щодо впливу червоного світла на формування і ріст бічних коренів, то припускають, що у цей процес включається фітохромна система тканин кореня, яка видозмінює мітотичну діяльність, що здійснюється при участі ІОК.

Для кількісного обліку росту кореневих культур використовують такі визначення: заміряють загальну довжину і щоденний приріст головного кореня, кількість і загальну довжину бічних коренів, вагу сирої і сухої речовини, біомасу коренів у одному культуральній посудині; об’єм кореневої системи, розмір клітин екзодерми тощо.

Культура ізольованих листків перспективна для вивчення тривалості їхнього життя, фізіології росту і розвитку в контрольованих умовах від становлення до завершення. Крім того, сегменти листка використовують для вивчення дії фізіологічно активних речовин, механізму переходу клітин до дедиференціації. Культура ізольованих листків використовується як метод для розмноження деяких видів рослин. Особливого значення культура ізольованих листків набула у зв’язку з розвитком методу виділення ізольованих протопластів.

Перші життєздатні культури листків були отримані для папоротей. Було виявлено, що у культурі ріст сповільнювався, а розвиток прискорювався, в результаті чого листки були менших розмірів, ніж in vivo. Зменшення розмірів листків, що культивуються було пов’язане головним чином зі зменшенням кількості, але не розміру клітин, що пов’язано з можливим усуненням впливу деяких речовин, які сприяють клітинному поділу.

На розвиток листків у культурі суттєвий вплив має вміст сахарози у середовищі:

- при низьких концентраціях формуються малі листки ювенільної морфології;

- при більш високих концентраціях формуються листки дорослого типу з виразною морфологічною складністю.

Залежно від цілей досліджень культивувати можна цілі листки (для розмноження), експлантати листків, листки апікальних бруньок. Перевагу слід надавати молодшим листкам або листкам з молодих рослин.

Експлантати листків більшості видів в умовах in vitro здатні до утворення калюсу і диференціації адвентивних бруньок, зародків, коренів. Шлях, по якому піде розвиток експлантата листка, залежить від співвідношення ауксинів та цитокінінів у живильному середовищі.

Частини квітки культивують з метою вивчення закономірностей їхнього розвитку, а також впливу факторів живильного середовища та інших умов, які індукують морфогенез. Як первинні експлантати в ізольованих умовах можна вирощувати цілі суцвіття, квіткові бруньки і окремі органи квітки (квітконіжки, пелюстки, квітколоже, маточка, чашолистики, пилок, пиляки). Результати, отримані при культивуванні різних органів квітки показали, що усі вони мають здатність до калюсоутворення та морфогенезу.

Культура ізольованих зав’язей перспективна для вивчення процесів запилення, впливу різних тканин квітки на розвиток зав’язі в плід. Перші дослідження розвитку зав’язей в ізольованій культурі пов’язані з іменем Ніча (1949, 1951). Він культивував квітки томатів, які запилювали за кілька днів до введення в культуру. Зав’язі ставали помітними через тиждень після посадки і поступово збільшувалися. Через 35 днів були червоні плоди, які за смаком нагадували звичайні томати. Більшість плодів мали життєздатне насіння, хоча його кількість була незначною. Якщо квітки ізолювали до запилення, то зав’язі формувалися лише на середовищі з ауксином.

На сьогоднішній день в умовах культури вирощують тканини плодів цитрусових (лимона, апельсина, мандарина), яблука, груші, персика, айви, авокадо. Перспективним є використання суспензійних культур плодів для вивчення гормональної регуляції процесів дозрівання, біогенезу природних сполук.

Заслуговує на увагу властивість тканин деяких плодів накопичувати в умовах in vitro крохмаль і синтезувати метаболіти вторинного обміну. Так тканина зрілих плодів цитрусових in vitro здатна до синтезу флавоноїдів, глікозидів, ефірних олій. Властивість продукувати деякі ароматичні летючі сполуки характерна калюсній і суспензійним культурам яблука.

На сьогодні кількість видів плодів, що культивують in vitro залишається обмеженою і основна увага сконцентрована на визначенні джерел живлення для індукції проліферації.

Культивування in vitro пилку і пиляків дозволяє отримувати гаплоїдні рослини і калюсну тканину. Отримання гаплоїдних рослин на штучному живильному середовищі із ізольованих пиляків і пилку називають андрогенезом. Культивування in vitro пилку і пиляків має великий інтерес для генетики і селекції, так як у гаплоїдів простіше виявити і відібрати цінні мутації, а за допомогою колхіцину можна отримати повністю гомозиготні диплоїдні рослини. Крім цього пилкові зерна, які запрограмовані на утворення гамет, в умовах культури переключаються на процеси, які властиві вегетативній клітині. Завдяки цьому, культура пилку і пиляків використовується у фізіологічних і біохімічних дослідженнях. Інтенсивні дослідження в цьому напрямку сприяли тому, що для 247 видів рослин, які належать до 88 видів і 33 родин розроблені прийоми отримання гаплоїдів (методом ізольованого пилку і пиляків), 40 видів із них економічно важливі – пшениця, рис, кукурудза, ячмінь, люцерна, льон, перець, апельсин, виноград, яблуня, картопля та інші.

В умовах культури індукція до росту мікроспор і утворення ембріоїдів може відбуватися двома способами:

1) прямим ембріогенезом;

2) непрямим шляхом - через утворення калюсу і індукування в ньому ембріогенезу.

Прямого розвитку ембріоїдів із пилкових зерен досягли у чотирьох родів із родини Solanaceae – Datura, Nicotiana, Atropa і Lucium.

Для отримання гаплоїдної тканини рекомендують використовувати пиляки в момент першого мітозу або відразу після нього. Під час ізолювання пиляків ні в якому разі не можна їх травмувати, бо це може призвести до загибелі всього пиляка, і, крім того, калюс може утворитися не з пилку, а з соматичних диплоїдних клітин.

Важливо, щоб пиляки були взяті з відносно молодих рослин, бо у старих рослин на кінець цвітіння утворюються дрібні бутони, які містять пиляки з гетерогенною сумішшю мікроспор і багато пилку з дефектами.

При культивуванні пиляків тютюну та беладонни на простому середовищі без вітамінів і гормонів відбувається ембріогенез. А на середовищах з регуляторами росту індукується проліферація соматичних тканин в результаті чого утворюється суміш калюсів з різним рівнем плоїдності.

Позбавитися конкуруючого росту соматичних тканин можна культивуючи пилок. Цей метод дає можливість позбутися інгібіторів, які містяться у тканинах пиляка. Складнощі методу культивування пилкових зерен полягають в необхідності індукування перших поділів пилку in vitro. Найбільший ефект на цей процес має вплив на відокремлені від рослин бутони пониженою температурою (5°С) протягом 3^х днів. Крім того, встановлено, що для перших поділів пилку при ембріогенезі необхідна присутність ауксину.

Застосування техніки культивування пиляків та пилку дозволило китайським вченим за короткий строк вивести понад 80 сортів і ліній рису, високоврожайних (до 75 ^ц/_га), стійких до різних патогенних мікроорганізмів, з широким спектром адаптивності. За допомогою цього ж методу в Одесі було отримано 20 сортів пшениць та 2 сорти ячменю. Крім цього, отримані in vitro гаплоїди можна використовувати в роботах по генетичній інженерії і клітинній селекції. У деяких випадках для дослідів по генетичній трансформації зручніше використовувати пилкові зерна ніж протопласти.

Культуру зародків використовують для вивчення процесів формування зародка на материнській рослині, з’ясування причин і умов клітинного поділу, диференціації та морфогенезу. Відомо, що період ембріонального розвитку організму характеризується високою активністю процесів клітинного поділу і диференціації.

На самих ранніх етапах ембріогенезу відбуваються активні поділи зиготи без диференціації. На послідуючих етапах починається диференціація. Клітини набувають здатності виконувати певну функцію, формується складний організм. Це неминуче супроводжується виникненням складної системи регуляторних механізмів, виникненням корелятивних зв’язків між ними. В основі складного процесу диференціації, морфогенезу, виникнення корелятивних зв’язків лежить зміна і регуляція активності генів на початкових етапах. Крім того, процеси ембріогенезу в нативних умовах зазнають впливу материнського організму. Цю залежність зародка від материнської рослини можна усунути відтворенням ембріогенезу в контрольованих умовах. Враховуючи це, метод вирощування ізольованих зародків ранніх етапів формування є єдиним із підходів, що дозволяє експериментально дослідити часову, послідовну реалізацію генетичної інформації, дію генів в ранній період індивідуального розвитку організму.

Всі дослідження з культури зародків in vitro варто розділити на дві групи.

В одних роботах в контрольованих умовах вирощували зрілі, в основному сформовані зародки, в інших – зародки на ранніх етапах ембріонального розвитку.

Дослідження по вирощуванню зрілих зародків, в основному, направлені на отримання дорослих рослин із абортивних зародків, несхожого в звичайних умовах насіння, отриманого в результаті віддаленої гібридизації.

За допомогою вирощування in vitro зародків насіння, що складно або довго проростає можна подолати період спокою і прискорити отримання дорослих рослин.

Вирощування в контрольованих умовах незрілих зародків допоможе дослідити первинні, елементарні процеси утворення біологічних структур, клітинного поділу і диференціації, органогенезу, морфогенезу. Особливо важливо здійснення і відтворення in vitro ембріогенезу, починаючи з перших поділів заплідненої яйцеклітини. Основна проблема, яка виникає при культивуванні незрілих зародків, пов’язана з пошуком шляхів збудження яйцеклітини до поділу.

Культура ізольованих меристем використовується для оздоровлення (звільнення від вірусів) та розмноження рослин. У фізіології та біохімії рослин культура in vitro апікальних меристем використовується головним чином, у дослідженнях морфогенезу.

Метод отримання безвірусних рослин із меристем базується на спостереженнях Лімассе і Корнуе (1949), які встановили, що вміст вірусів у хворій рослині зменшується у напрямку до верхівки рослини, а власне меристема може бути цілком вільна від вірусної інфекції.

Меристемою звичайно називають тканину верхівки пагона розміром 0,1 мм – 1 см. Власне апікальну меристему – конус клітин, що активно діляться висотою 0,1 мм і шириною 0,25 мм складно виділити без пошкодження і індукувати до росту. У зв’язку з цим часто виділяють саму меристему і один або два листкових примордії. Рослинний матеріал для вичленення меристем доцільно брати із молодих проростків, новоутворених бруньок або молодих пагонів. Не варто використовувати меристеми із пагонів, які мають квітки.

На сьогодні практичні результати по оздоровленню рослин від вірусної інфекції отримані для картоплі, суниці, гвоздики, яблуні, черешні, шовковиці, смородини та ін. Найбільш детально розроблені умови культивування меристем картоплі.

Метод культури тканини меристем успішно використовують для прискореного розмноження рослин і масового виробництва посадкового матеріалу сільськогосподарських рослин, а також декоративних рослин, наприклад, орхідей.

Використання методу культури меристем для розмноження рослин набуває особливого значення у разі, коли звичайний спосіб вегетативного розмноження є тривалим процесом, а вихідний матеріал представляє цінність, як, наприклад, у орхідей. Розмноження орхідей поділом бульб – це повільний процес, розвиток повноцінної рослини потребує 10 років, а тому набуває значення метод розмноження орхідей за допомогою меристем, що культивуються in vitro (з 1965 року).

У орхідей апікальна меристема не розвивається у пагін, а формує протокорми – особливі ембріональні структури, які здатні до вегетативного розмноження. Так, кожний експлантат дає мінімум 2–3 протокорми через 4–6–8 тижнів, які протягом 4–5 тижнів розростаються. Після чого їх ділять і переносять на свіже середовище, де протягом 6–7 тижнів формуються пагони і корені. Сформовані рослини відділяють, а протокорми продовжують клонувати. Період розвитку від меристеми до пробірочної рослинки становить приблизно 20 тижнів.

Проте слід зазначити, що методика вегетативного розмноження in vitro з використанням культури меристем має певний недолік, який пов’язаний зі зменшенням генетичного різноманіття: оскільки всі рослини даного виду походять із однієї меристеми, то нові хвороби можуть стати для них катастрофічними, так як ці рослини генетично ідентичні (або майже ідентичні) одна одній, і мають однакову чутливість до патогенних мікроорганізмів або паразитів. Тому, наряду з розвитком техніки масового розмноження необхідно створювати банки зародкової плазми (колекції насіння), для того щоб зберегти генотипи, які необхідні для підтримання генетичного різноманіття.

Контрольні запитання і завдання

1. Для вивчення яких процесів використовують культуру ізольованих коренів?

2. Який вихідний рослинний матеріал використовують для отримання культури ізольованих коренів?

3. Які особливості культивування ізольованих коренів?

4. Наведіть приклади практичного використання культури ізольованих листків.

5. Яке практичне значення культивування in vitro пилку і пиляків?

6. Чому перевага надається культивуванню пилку, а не пиляків?

7. Яке значення культури ізольованих зародків?

8. Що таке меристема?

9. Для яких цілей використовують культуру ізольованих меристем?

10. Що таке протокорм?