Методы выделения и очистки ферментов - это методы выделения и очистки белков

Очистка фермента начинается с выделения данного фермента из грубого клеточного экстракта, содержащего множество других компонентов. Небольшие молекулы удаляются диализом или гель-фильтрацией, нуклеиновые кислоты осаждаются путем добавления антибиотиков (стрептомицина) и т.д. Основная проблема—отделить нужный фер­мент от сотен химически и физически сходных бел­ков. Если контроль за выделяемым белком доставляет довольно много хлопот исследователю, о присутствии фермента и его количестве на всех этапах очистки можно следить по его активности. В общем виде под активностью понимают количество фермента или биологического материла, содержащего фермент, которое при определенных условиях катализирует в единицу времени превращение определенного количества реагента, называемого субстратом. Активность - это изменение количества субстрата под влиянием фермента в единицу времени. Под изменением субстрата понимают снижающееся в единицу времени количество субстрата или же увеличивающееся количество продукта. Понятие "активность фермента" по сути дела идентична понятию "скорость ферментативной" реакции. Ферментативная активность выражается в единицах активности. В связи с существованием различных систем единиц исчисления введена интернациональная (стандартная) единица активности. Она носит символ "U" (unit-единица) и определяется как 1 мкмоль субстрата/мин. В системе СИ в качестве единицы ферментативной активности используют "катал" (kat). Катал определяется как 1 моль/сек.

1kat = 1 моль/сек.

Размерность её слишком велика, на практике пользуются меньшими кратными значениями, начиная с нанокатала (нкат). Это одна миллиардная катала или 10^-9 кат. В сравнении с международной единицей следующее уравнение

1 U = 16,67 нкат

В практике лабораторий широко пользуются понятием удельная активность. Для этого число cтандартных единиц пересчитывают на какую-либо единицу сравнения. Это может быть мг белка в пробе или объем исследуемой биологической жидкости. Определение активности ферментов широко распространено в любой современной клинической лаборатории.

При исследовании кинетики реакций используется и такое понятие как молекулярная активность. Она показывает, сколько молекул субстрата в секунду превращаются в продукт 1 молекулой фермента и используется для сравнительной характеристики активности нескольких ферментов.

Пример вычисления активности фермента:

Исходные данные:	Через 10 мин:
25.0 x 10-3 моль л--1 пептида-субстрата, объем реакционной смеси 2.5 мл, 0.50 µг химотрипсина[4]	18.6 x 10-3 моль л--1 пептида -субстрата, Объем реакционной смеси 2.5 мл, 0.50 µг химотрипсина.
Использованный субстрат	= 6.4 x 10-3 моль л-1 за 10 мин
Скорость реакции	= 6.4 x 10-4 моль л-1 мин-1
Активность Фермента (скорость x объем)	= 6.4 x 10-4 моль л-1 мин-1 x 2.5 x 10-3 л = = 1.6 x 10-6 моль мин-1
Удельная активность (активность / масса)	= 1.6 x 10-6 моль мин-1 / 0.50 µг = = 3.2 x 10-6 моль µг-1 мин-1
Число оборотов (уд. акт. x молярная масса)	= 3.2 x 10-6 моль µг-1 мин-1 x 25,000 x 106 µг моль-1 = 8.0 x 104 мин-1 =1330 сек-1

Если удельная активность, рассчитанная выше, относится к чистому химотрипсину, образец, давший, например, удельную активность 2.0 x 10^-7 моль µг^-1 мин^-1 - 100 % x 2.0 x 10^-7 / 3.2 x 10^-6 или 6.3 % чистоты. 1.0 µг такого образца на самом деле содержит лишь 0.063 µг химотрипсина и 0.937 µг примесей.

Методы исследования активности определяются механизмом реакции и природой опре

Рис2-4. Молярное поглощение НАД⁺,НАДН+Н⁺, ФАД, ФАДН₂ при разных длинах волн поглощаемого света

деляемого вещества. Наиболее широко используются:

· Измерение изменения спектральных свойств (измерение поглощения света в видимой или ультрафиолетовой области, измерение флюоресценции) при помощи спектрофотометров, ФЭКов, спектрофлуориметров. Эти методы применяют и для определения количества продуктов или субстратов реакции, и для изменений количества коферментов, участвующих в реакции. Последнее нашло широкое применение в практике клинических биохимических лабораторий. В основе этих методов лежит закон Beer-Lambert: A = e x c x l = log (I₀/I) (e, поглощение 1 M раствора вещества при специфической длине волны или молярный коэффициент экстинкции; c, концентрация; A, поглощение; l, длина в см кюветы спектрофотометра; I₀, интенсивность падающего света; I, интенсивность прошедшего света). В случае, если молярный коэффициент экстинкции (e) исследуемого вещества неизвестен, исследователь определяет экспериментально зависимость между поглощением света исследуемого раствора и концентрацией этого вещества и использует полученную закономерность в форме стандартного (калибровочного) графика.

На рисунке 2-4 показаны спектральные характеристики коферментов НАД и ФАД в окисленной и восстановленной форме. Измерение поглощения при 340 нм используется для количественной оценки активности ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции c участием НАД. Вот пример такого расчета для реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой В этой реакции молочная кислота окисляется, передавая водороды на НАД⁺. При этом НАД⁺ восстанавливается до НАДН +Н⁺., который в отличие от НАД⁺ поглощает свет с длиной волны 340 нм. Допустим, за время проведения реакции поглощение при длине волны 340 нм изменялось на 0.31 единицы в минуту. Измерения проводили в кювете шириной 1 см. Коэффициент молярной экстинкции для НАДН при 340 нм e = 6200 л моль^-1 см^-1.

Увеличение [НАДH] =

Увеличение поглощения e. l

0.31

=5.0 х10-5 моль/л

Эту величину можно использовать для оценки скорости реакции.

· Измерение изменений концентрации высвобождаемых или поглощаемых во время реакции H⁺ или ОН^- при помощи pH-стата (устройство, которое автоматически добавляет кислоту или основание, сохраняя постоянство pH в реагирующей смеси)

· Химический анализ с использованием высокоразрешающей жидкостной или газовой хроматографии, или ЯМР или тонкослойной хроматографии. (АТФазы)

· Изотопный анализ (например, с использованием радиоактивного ³²P)

·

Сопряженные реакции – используются в случаях, если нет возможности прямо определить количество продукта исследуемой реакции. В таких случаях в реагирующую смесь добавляется фермент (Е₂) катализирующий превращение образующегося продукта в реакции, которую можно оценить количественно, одним из вышеперечисленных методов.

Если фермент Е₂ присутствует в избытке, скорость образования C отражает скорость образования В.

Например, сопряженное исследование активности глюкокиназы (используется избыток глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и НАДФ⁺)

Глюкоза + AТФ → глюкоза 6-Ф + AДФ: (катализируется глюкокиназой –Е₁)
Глюкоза-6-Ф + НАДФ⁺ → 6-фосфоглюконолактон + НАДФН + H⁺ : (катализируется глюкоза-6Ф –дегидрогеназой – Е₂):

Скорость образования НАДФH (измеряется по поглощению при 340 нм) пропорциональна активности глюкокиназы (см выше)

Классические методы очистки. Широко используются следующие методы очист­ки: осаждение различными концентрациями солей щелочно - земельных металлов (чаще всего сульфата аммония или сульфата на­трия) или сочетанием их с органическими растворителями (ацетоном, этанолом), дифференциальная денатурация путем нагревания или изменения рН, дифференциалъное центрифугирование, гель-фильтрация и электрофорез.

Для быстрой очистки ферментов успешно применяется избирательная адсорбция и элюция белков с ионобменников (ДЭАЭ или КМ производные целлюлозы или других полимеров). Широко используется также: разделение белков по размерам при помощи гель-фильтрации. Все эти методы являются, однако, относительно мало избирательными (если они не используются в сочетании) для выделения ин­дивидуального белка из сложной смеси клеточных ферментов.Значительно упрощается такая задача при помощи метода аффинной хроматографии.

Табл 2-1. Типичная процедура очистки одного из ферментов печени
Этапы очистки	Суммарная активность ед	Суммарный белок мг	Удельная активность ед/мг	Выход %
1. Водно-солевой экстракт плаценты			0.408	(100)
2. Осадок,образующийся после осаждения 65% -ным (NH4)2SO4			0.674	90.7
3. Осадок,образующийся после осаждения 35-65% -ным (NH4)2SO4			3.781	85.2
4. Активная фракция после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе осадка фракции 3			8.252	78.5
5. Активная фракция после хроматографии фракции 4 на фосфоцеллюлозе			59.1	58.4
6. Активная фракция после гель фильтрации фракции 5		110.8	227.2	53.4
7. Повторение этапа 6.		88.8	216.7	40.1

Типичная процедура очистки одного из ферментов печени с хорошим выходом и 227-кратной степенью очистки препарата описана в табл 2-1. Обратите внимание на изменение при очистке удельной актив н ости и выхода фермента. Процедура направлена на достижение максимальной удельной активности (число единиц активности фермента на 1 мг белка) при возможно большем выходе исходной суммарной активности. Из данных таблицы видно, что уже в процессе очистки решаются проблемы исследования свойств фермента. Повторение этапа 6 привело к снижению удельной активности, что возможно связано с особенностями физико-химических свойств выделяемого фермента.