Експресуючі вектори

Найважливішою задачею генної інженерії є експресія клонованих генів. Для досягнення ефективної експресії вже сконструйовано багато специфічних експресуючих векторів. Універсальної стратегії оптимізації експресії клонованих генів не існує. Більшість таких генів мають унікальні властивості, тому оптимальні системи експресії для кожного з них доводиться підбирати індивідуально.

При конструюванні експресуючих векторів, насамперед, враховують особливості регулюючої системи рекомбінантного гена, виходячи з того, в яких генетичних умовах передбачається експресія. Необхідним елементом експресуючого вектора є ділянка сильного промотора, безпосередньо за якою вбудовується потрібний ген. Такий промотор має високу спорідненість до РНК-полімерази, тому необхідна ділянка ефективно транскрибується. Наприклад, для всіх промоторів E.coli є обов’язкові послідовності TTGACA та TATATT (перша поблизу положення –35 п.н., друга –10 п.н. відносно сайта ініціації транскрипції). Але використання сильного постійно функціонуючого промотора не завжди зручно. Безперервна експресія гена може бути руйнівною для клітини, оскільки викликає вичерпання енергетичних ресурсів і порушення метаболізма. Таким чином, необхідно, щоб клонований ген експресувався тільки в потрібний відрізок часу, а для цього використовуються сильні регульовані промотори. Плазміди, сконструйовані таким чином, називаються експресуючими векторами.

Найбільш широко використовуються промотори lac- і trp- оперонів Е.coli; спеціально сконструйований tac-промотор; pL-промотор бактеріофага l. З кожним із них зв’язуються відповідні білки-репресори, які регулюють активність промоторів. При відсутності дії індукторів молекули репресора, ген якого експресуеться конститутивно, звя’зуються з оператором та перешкоджають взаємодії РНК-полімерази з промотором, під контролем якого знаходиться клонований ген. Індукція може бути хімічна (у випадку lac-промотора використовується природний індуктор – лактоза, або її синтетичний аналог, що звя’зується з репресором і порушує його взаємодію з операторною ділянкою ДНК); або термічна (pL-промотор фага l регулюється термочутливим репресором, який зберігає свою активність лише при пермісивній температурі 28-31°С, при підвищенні температури відбувається інактивація репресора). Ген, що кодує репресор, можна вбудувати в експресуючий вектор, або він може знаходитись в самій бактеріальній клітині.

На ефективність транскрипції впливає будова не тільки регулюючої частини, а й структурної. Гени еукаріотів не можуть експресуватись в клітинах прокаріотів, оскільки в останніх відсутні системи сплайсінгу. Тому замість структурної частини еукаріотичного гену використовується кодуюча ДНК, одержана через зворотню транскрипцію м-РНК цього гену. Велике значення має правильне положення термінуючих сигналів, наявність некодуючих послідовностей на 3′ і 5′ кінцях зменшують ефективність експресії.

Ефективність трансляції у бактерій безпосередньо пов’язана з наявністю ділянки Шайна-Дальгарно, що являє собою коротку послідовність нуклеотидів, збагачену пуриновими основами, яка знаходиться на відстані 4-9 кодонів попереду від AUG-кодону. Ця ділянка забезпечує ініціацію трансляції з правильного кодона.

Серед факторів, що впливають на трансляцію, треба згадати частоту кодонів, які використовуються для кодування амінокислот. Невідповідність у використанні нуклеотидних послідовностей в організмах різних видів значно знижує рівень експресії.

Відразу за ATG-кодоном вектора знаходиться полілінкер з унікальними сайтами рестрикції, в які відбувається вбудування кодуючої частини клонованого гену. При транскрипції утворюється хімерна м-РНК, 5′-кінцева частина якої відповідає нуклеотидній послідовності вектора, кодує декілька амінокислот природного гена, регулюючі послідовності якого використані для конструювання експресуючого вектора, 3′-кінцева частина такої РНК буде відповідати клонованому фрагменту ДНК. Якщо рамка зчитування цих двох частин співпадає, при трансляції буде утворюватись химерний поліпептид.

В багатьох випадках, особливо при одержанні невеликих чужорідних пептидів, послідовність нуклеотидів, що кодує такий пептид з’єднують в одній рамці зчитування в складі експресуючого вектора з бактеріальним геномом, що кодує білок. В такому випадку буде утворюватись гібридний білок, в якому рекомбінантний пептид буде захищений бактеріальним білком від протеолітичної деградації. Відділення чужорідного пептиду від бактеріального білку можна здійснити хімічним або ферментативним шляхом. Існує також метод захисту, при якому послідовності ДНК, що кодують рекомбінантний поліпептид, з’єднують з сигнальними послідовностями амінокислот білків, які секретуються в навколишнє середовище.