Лекция 2. Вирусы гриппа, парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита

Учреждение образования

«Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия

ветеринарной медицины»

 

Р.Б. Корочкин, А.А. Гласкович

 

 

КУРС ЛЕКЦИЙ ПО ПРЕДМЕТУ
«ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ»

 

 

Учебно-методическое пособие для студентов по специальности

1-74 03 02 «Ветеринарная медицина»

 

 

 

 

ВИТЕБСК

ВГАВМ

 

 

УДК 619:578(075.8)

ББК 48 я73

К68

Рекомендовано в качестве учебно-методического пособия

редакционно-издательским советом УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»

от 2012 г. (протокол №)

 

Авторы:

канд. вет. наук, доц. Корочкин Р.Б, канд. вет. наук, доц. Гласкович А.А.

 

Рецензенты:

д-р вет. наук, проф. Прудников В.С., канд. вет. наук, доц. Машеро В.А

 

К68	Корочкин, Р.Б. Курс лекций по предмету «Частная вирусология»: учеб.- метод. пособие / Р.Б. Корочкин, А.А. Гласкович. – Витебск: ВГАВМ, 2012 – 68с. ISBN 978-985-512-084-2

 

Учебно-методическое пособие написано в соответствии с программой по дисциплине «Вирусология» для высших с.-х. учебных заведений по специальности 1-74 03 02 «Ветеринарная медицина». Содержит в себе девять лекций по предмету «Частная вирусология», излагающих основные биологические характеристики вирусов- возбудителей болезней животных, характеристику вызываемых ими болезней, лабораторную диагностику инфекций. Учебно-методическое пособие предназначено для преподавателей и студентов факультета ветеринарной медицины.

 

УДК 619:578(075.8)

ББК 48 я73

 

ISBN 978-985-512-084-2

© Р.Б. Корочкин, А.А. Гласкович, 2008 © УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины, 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Лекция 1. Вирусы болезни Ауески, бешенства, ящура …...…….....……..... 4

Лекция 2. Вирусы гриппа, парагриппа-3, инфекционного

ринотрахеита …………………………………………………………..…. 10

Лекция 3. Вирусы диареи, аденовирусной инфекции …...…………...…… 16

Лекция 4. Вирусы оспы млекопитающих и птиц. Вирус лейкоза

крупного рогатого скота ………………………………………………… 20

Лекция 5. Вирусы респираторно-репродуктивного синдрома свиней,

гастроэнтерита свиней, энзоотического энцефаломиелита

(болезни Тешена) …..…….........................................................…………. 26

Лекция 6. Вирусы европейской и африканской чумы свиней.

Вирус парвовирусной инфекции свиней ……………………………….. 33

Лекция 7. Вирусы ньюкаслской болезни, инфекционного бурсита,

инфекционного ларинготрахеита, болезни Марека, инфек-

ционного бронхита кур ………………………………………………….. 41

Лекция 8. Вирусы плотоядных (чума плотоядных, парвовирусный

энтерит плотоядных, алеутская болезнь норок)……………………..…. 56

Лекция 9. Прионные болезни животных (спонгиоформная энцефалопатия крупного рогатого скота, скрепи овец).……………………………….... 63

ЛЕКЦИЯ 1. ВИРУСЫ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ, БЕШЕНСТВА,

ЯЩУРА

Болезнь Ауески - остро протекающая болезнь сельскохозяйственных животных, пушных зверей и грызунов, характеризующаяся признаками поражения головного и спинного мозга, сильным зудом и расчесами (у всех животных, кроме свиней).

У свиней клиническое проявление болезни Ауески различно, но во всех случаях без зуда. У свиней, зараженных внутриутробно и в первые 10 дней жизни, болезнь носит септический характер. Признаки поражения центральной нервной системы характеризуются судорогами мышц по всему телу. Гибель наступает через 4-12 часов после проявления первых клинических признаков.

У поросят в возрасте 10 дней- 3 месяца клиническая картина характеризуется высокой лихорадкой (до 42ºС), слизистыми истечениями из носа. Затем появляются признаки поражения центральной нервной системы – беспокойство, манежные движения, судороги шейных и жевательных мышц, мышц позвоночника и всего тела. Гибель при этой форме достигает 70-100%.

У свиноматок и подсвинков старше 5 месяцев болезнь проявляется в виде доброкачественной формы с поражением дыхательной системы и обильным слюнотечением. Через 3-4 дня животное выздоравливает, а признаки поражения центральной системы проявляются редко. Супоросные свиноматки могут абортировать. В природе существует циркуляция слабовирулентных штаммов вируса болезни Ауески, характеризующихся низким нейротропизмом. Эти штаммы вируса зачастую вызывают только носительство у свиней.

У крупного рогатого скота болезнь характеризуется лихорадкой и сильным зудом в области головы, реже – на других участках тела. Случаи выздоровления очень редки. У мелкого рогатого скота клиническая картина болезни Ауески аналогична, однако признаки возбуждения животного появляются очень редко. У плотоядных животных болезнь Ауески характеризуется сильным зудом, беспокойством и возбуждением без признаков агрессивности (в отличие от бешенства). Во всех случаях плотоядные, в отличие от других животных, не выделяют вирус во внешнюю среду, являясь таким образом экологическим тупиком. У лошадей болезнь протекает преимущественно доброкачественно.

Возбудителем болезни Ауески является вирус из семейства Herpesviridae рода Varicellavirus. Вирус пантропен и сразу после заражения появляется в верхних дыхательных путях и легких, а через 48 часов может обнаруживаться в головном мозгу, селезенке, печени и других органах. Первично вирус попадает в носоглотку, затем распространяется по организму лимфагенным и нейрогенным путем. При проникновении через кожу вирус первично реплицируется в подкожной клетчатке, затем лимфагенно и гематогенно распространяется по всему организму. У павших животных наивысшая концентрация вируса обнаруживается в миндалинах, лимфатических узлах области головы и легких, что следует учитывать при отборе патматериала. Для вируса характерна длительная персистенция в организме переболевшего животного – у свиноматок свыше 180 дней. В природе важным резервуаром являются мыши и крысы.

Лабораторная диагностика болезни Ауески основана на выделении вируса из патматериала с последующей его идентификацией, а также выявлении специфических антител в крови переболевших животных.

Патматериалом для выделения вируса является головной мозг, кусочки легких, селезенки, печени, лимфоузлов, миндалин, при жизни вирус может быть выделен из носовых секретов, от абортировавших животных исследуют плоды. При отборе патматериала следует учитывать неравномерное распространение вируса в разных участках головного мозга, поэтому отбирают минимум по 2-3 пробы из разных участков мозга (обычно мозжечка, продолговатого и больших полушарий головного мозга). Патматериал доставляют в термосе со льдом или допускают его консервирование в 50%-ном глицерине. В сопроводительном документе обязательно указывают срок последней вакцинации и название вакцины.

Подготовка материала. В лаборатории делают гистосрезы из тканей мозга, а из оставшейся массы материала готовят 10%-ную суспензию по общепринятой методике. При этом кусочки из разных отделов мозга целесообразно объединять в общую пробу. После подготовки материала гистосрезы используют для исследования в РИФ, а суспензию – для постановки биопробы.

Реакцию иммунофлуоресценции проводят с использованием люминесцентных иммунных сывороток. В положительных случаях обнаруживают полосы флуоресцирующих нейронов. При этом в препаратах из мозжечка флуоресцирующие клетки располагаются более беспорядочно. Во всех случаях специфическая флуоресценция характеризуется свечением в виде пыли или мелких гранул. Положительный результат РИФ должен быть обязательно подтвержден результатами постановки биопробы.

Биопроба. Приготовленную суспензию вводят кроликам внутримышечно или подкожно в объеме 1 мл, а оставшуюся часть суспензии хранят при низкой температуре до конца экспертизы. Инкубационный период составляет 36-48 часов, реже – несколько дней. Положительный результат биопробы характеризуется либо признаками поражения центральной нервной системы у кроликов – возбуждение, затем параличи конечностей и гибель, либо сильным зудом на месте введения. Если кролики погибают без наличия вышеуказанных признаков, то биопробу повторяют, используя патматериал от павшего животного.

Биопробу считают положительной при наличии характерной клинической картины с последующей гибелью кролика через 2-10 дней. В случае отрицательного или сомнительного результата биопробы проводят выделение вируса на культурах клетках.

Выделение вируса на культурах клеток. Второй частью приготовленной суспензии заражают культуры клеток по общепринятой методике. Для выделения вируса используют первичные субкультуры (почек или щитовидной железы свиньи, фибробластов РКЭ), а также перевиваемые культуры клеток (РК-15, ВНК-21). Репродукция вируса болезни Ауески характеризуется развитием ЦПД на 4-5-й день после заражения: в культурах клеток из эпителиальных и эмбриональных клеток происходит образование синцития с последующим отслаиванием монослоя, из фибробластов РКЭ – округление клеток, зернистость и вакуолизация. В случае отсутствия ЦПД в культурах клеток на 5-й день культивирования проводят повторный пассаж. Однако общее количество слепых пассажей не должно превышать 3-5 из-за снижения вирусом своей вирулентности. При наличии характерного типа ЦПД выделенный вирус должен быть идентифицирован в РН.

Идентификация вируса. Идентификацию вируса в РН осуществляют на культуре клеток того же вида, где вирус был изолирован. Для этого используют культуральную жидкость, из которой готовят десятикратные разведения (10^-1- 10^-7), положительную и отрицательную сыворотку, которые в реакции используют в разведении. 1:10. Учет РН на культурах клеток проводят через 2-5 суток. Вирус считается идентифицированным, если индекс нейтрализации составляет 2 lg (100 раз).

Серологическую диагностику болезни Ауески проводят в виде плановых исследований свинопоголовья хозяйств-поставщиков, а также при определении степени благополучия хозяйства по болезни Ауески. Она основана на выявлении специфических антител в сыворотке крови переболевших животных.

Наличие антител определяют в РН на культурах клеток, определяя титры вируснейтрализующих антител в сыворотке. В реакции используют двукратные разведения исследуемой сыворотки (от 1:2 до 1:16) и постоянную дозу вируса (1000 ТЦД₅₀ / 0,1 мл).

Ящур - остро протекающая высококонтагиозная болезнь парнокопытных, проявляющаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистой оболочки рта, кожи венчика и вымени; у молодых животных – поражением миокарда скелетных мышц. У взрослых животных болезнь протекает доброкачественно и сопровождается появлением на поверхности губ, языка, слизистой оболочки щек везикул, наполненных жидкостью (афты). Часто в патологический процесс могут вовлекаться конечности и вымя.

Возбудителем ящура является вирус из семейства Picornaviridae рода Aphtovirus. Это РНК-геномный вирус, содержащий в составе вириона нефрагментированную линейную плюс-нить РНК. Молекула нуклеиновой кислоты покрыта белковой оболочкой (капсидом), которая состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии. Капсид построен из четырех основных структурных полипептидов, обозначаемых VP1, VP2, VP3, VP4, первый из которых ответственен за образование вируснейтрализующих антител.

В антигенном отношении вирус ящура неоднороден и обладает плюрализмом. В настоящее время известно 7 антигенных типов вируса ящура: А, О, С, SAT1, SAT2, SAT3 и Азия. Серотипы А, О, С распространены повсеместно, тип Азия 1 выявлен только в азиатских странах, серотипы SAT регистрируются в Африке. Кроме того, внутри основных типов существуют подтипы, или сероварианты, количество которых различно у каждого серотипа.

Лабораторная диагностика ящура может проводиться в двух направлениях: выделение и идентификация вируса (ранняя диагностика) или обнаружение специфических антител у животных-реконвалесцентов (ретроспективная диагностика). Первое направление лабораторной диагностики проводят в случае первичного появления ящура среди поголовья с обязательной типовой и вариантной идентификацией вируса.

Отбор патматериала. Для исследования отбирают патматериал в виде стенок невскрывшихся афт от 2-3 больных животных в количестве не менее 5-10 г. У крупного рогатого скота отбирают афты с языка, у свиней – с пяточка или вымени, у мелкого рогатого скота – с беззубого края верхней челюсти, кожи межкопытной щели и венчика. При отсутствии афт берут кровь во время лихорадки. От трупов молодняка отбирают лимфоузлы головы, поджелудочную железу и миокард.

Подготовка материала. Поступивший в лабораторию материал разделяют на две части: одну используют для постановки РСК, а вторую хранят при минус 20ºС для дальнейшего исследования на случай получения отрицательного результата реакции.

Подготовка материала включает измельчение и гомогенизацию со стерильным нейтральным стеклом и двойным количеством изотонического раствора (33%-ная суспензия). Эту суспензию экстрагируют 2 часа при комнатной температуре, затем промораживают при минус 20ºС в течение 5-18 часов. После размораживания центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 30 или 15 минут соответственно. Надосадочную жидкость разделяют на две части: большую часть инактивируют при 58ºС в течение 40 минут и используют в РСК, другую (1-2 мл) после добавления антибиотиков используют для биопробы.

Полученный вируссодержащий материал используют для постановки РСК или РДСК для идентификации вируса ящура, а также определения его типовой и вариантной принадлежности.

Постановка биопробы. При получении отрицательных и сомнительных результатов РСК ставят биопробу или проводят заражение культуры клеток. Для этого могут быть использованы мыши, морские свинки. Биопроба на мышах заключается в заражении 4-6-ти дневных мышей-сосунов по 0,1 мл подкожно или внутрибрюшинно. Положительный результат биопробы характеризуется появлением парезов и параличей с гибелью на 2-5-й день после заражения.

Биопроба на морских свинках заключается в заражении не менее 5 лабораторных животных внутрикожно в плантарную поверхность задних лапок методом туннелирования в дозе 0,2-0,5 мл. После появления первичных поражений на 2-5-й день животное убивают. Генерализованная инфекция у морских свинок наступает только при заражении адаптированными к ним штаммами вируса.

Выделение вируса на культурах клеток осуществляют путем заражения клеточного монослоя первично-трипсинизированных культур почки свиньи или телят. Вирус ящура вызывает развитие характерного ЦПД в виде деструкции. Во всех случаях положительной биопробы или появления ЦПД в культурах клеток наличие вируса ящура должно быть подтверждено в РСК с его вариантной типизацией.

Идентификацию выделенного вируса ящура проводят с помощью РСК, при этом учитывают реакцию по 100%-ному гемолизу. При отрицательном результате РСК (что может быть обусловлено малым количеством антигена) можно ставить РДСК с удвоенным количеством типовых сывороток и 2-3 усл. ед. комплемента или РСК с повышенным количеством антигена и активности комплемента и сывороток.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Материалом для исследования служат сыворотки крови подозреваемых животных. Отбирают кровь от таких животных не ранее, чем через семь дней после появления клинической картины или вакцинации. Направляют не менее 5-10 проб сывороток крови от каждой возрастной группы. Выявление антител в сыворотках крови может проводиться в обычных ветеринарных лабораториях и не требует создания строгих санитарных режимов исследования. Наличие специфических антител определяют вышеуказанными реакциями, а также дополнительно НРИФ, а также реакцией серозащиты на мышах-сосунах.

Бешенство животных – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. К вирусу болезни восприимчивы все виды животных, а также человек.

В развитии клинической формы болезни различают три периода: продромальный, период возбуждения и параличей. Продромальная стадия характеризуется повышением чувствительности животного к внешним раздражителям (шум, свет, прикосновение). Стадии возбуждения свойственны приступы буйства и ярости, а также судороги. В период параличей у животного снижается или вовсе исчезает болевая чувствительность, развиваются параличи, нарушается деятельность центров кровообращения и дыхания.

Кроме того, у многих животных бешенство может протекать в буйной форме с преобладанием процессов возбуждения или в тихой форме с преобладанием процессов угнетения. Случаи выздоровления при бешенстве редки.

Возбудителем бешенства является вирус из семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus, представляющий РНК-геномный вирус с единой односпиральной линейной молекулой РНК. В зрелом вирионе содержится несколько групп белков, наиболее важными из которых являются белки, обозначаемые как белки N, M, G. Белок N непосредственно связан с РНК вируса, формируя в комплексе с нуклеиновой кислотой рибонуклеопротеид (РНП). Этот белок индуцирует образование комплементсвязывающих антител в организме зараженного животного, однако эти антитела не защищают животное от заражения. Белок М содержится в капсиде вируса и участвует в упаковке РНП в виде спирали. Суперкапсид всех рабдовирусов содержит наружный белок G, имеющий гликопротеиновую природу. Поверхностный белок G вызывает формирование вируснейтрализующих антител в организме зараженного животного, которые играют главную роль в защите от инфекции.

До настоящего времени установлено 7 генетических линий в роде Lyssavirus, разделенных на 4 серотипа вируса бешенства, что обусловлено различием в составе мембранного белка, однако в ветеринарной практике серотипизацию выделенных вирусов проводят редко, так как большинство вирусов, изолируемых при клинических случаях болезни, относятся к одному сероварианту (классический вирус бешенства, генотип 1, серотип 1). Все остальные лиссавирусы, хотя и вызывают болезнь со сходными с классическим бешенством клиническими признаками, большого эпизоотологического значения не имеют.

Вирус выделяется со слюной инфицированного животного за 10 дней до появления первых клинических признаков, поэтому все покусавшие животные должны быть изолированы на срок 15 дней под наблюдением ветеринарного врача. При появлении характерной клинической картины диагноз на бешенство может быть установлен только лабораторным путем.

Отбор и подготовка материала. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мелких животных, от крупных – голову или головной мозг. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в целлофановый пакет, мозг – в банку с резиновой пробкой, залитой парафином. Консервирование материала в 50%-ном глицерине нежелательно, так как в этом случае невозможно проведение достоверного серологического исследования. Вскрытие трупа и отбор патматериала следует проводить в условиях стерильности при строжайшем соблюдении мер личной профилактики: руки защищают двумя парами перчаток – хирургических и анатомических, для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот - шестислойную марлевую повязку. Кроме того, ветеринарный персонал должен быть предварительно вакцинирован против бешенства.

Лабораторная диагностика бешенства включает:

- обнаружение специфических телец-включений Бабеша-Негри при гистологическом исследовании;

- выявление вирусного антигена в реакции иммунофлуоресценции;

- выявление вирусного антигена в реакции иммунодиффузии;

- постановку биопробы на белых мышах.

Обнаружение специфических телец-включений проводят после окраски зафиксированных препаратов из левой и правой сторон головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кора полушарий, продолговатый мозг) по Селлерсу или Муромцеву. При этом тельца Бабеша-Негри по окраске по Селлерсу выглядят как четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в цитоплазме, при окраске по Муромцеву – в виде темно-синих гранулярных образований, чаще расположенных вне нервных клеток.

Постановка РИФ. Одновременно с исследованием на обнаружение телец-включений вторую часть мазков исследуют в реакции иммунофлуоресценции. В диагностической практике проводят прямой метод РИФ с применением антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина. Фиксацию препарата осуществляют в охлажденном (8-10ºС) ацетоне на срок не менее 4 часов. Антиген вируса бешенства выявляется в виде ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках или (чаще) вне клеток. Диагноз на бешенство считается установленным при обнаружении в нескольких полях зрения достаточного количества (не менее 10) типичных гранул с характерным свечением или множества мельчайших точек. В случае получения отрицательных результатов гистологического и серологического (в РИФ) исследований проводят постановку РИД с целью выявления антигена и постановку биопробы.

Постановку РИД проводят микрометодом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ный агаровый гель по общепринятой методике. Антигеном для реакции служат измельченные пинцетом в гомогенную пастообразную массу кусочки головного мозга. При этом антиген помещают в 4 раздельные центральные лунки: материал с аммоновых рогов, коры полушарий, мозжечка и продолговатого мозга. При получении отрицательного результата окончательный диагноз ставят по результатам биопробы.

Биопробу проводят на 6-10 молодых мышатах массой 16-20 г или мышатах-сосунах массой 6-8 г, причем последние являются более чувствительными к вирусу. Перед постановкой биопробы из оставшегося материала готовят 10-%-ную суспензию по общепринятой методике. Половину из используемых в эксперименте мышей заражают интрацеребрально в дозе 0,015 – 0,03 мл, а остальных – подкожно в верхнюю губу в дозе 0,1-0,2 мл. Ежедневное наблюдение за мышами ведут в течение 30 дней, причем гибель в первые 48 часов после заражения не учитывается.

Экспериментальная инфекция у мышей характеризуется появлением симптомов, включающих взъерошенность шерсти, горбатость спины, нарушение координации движения, параличи задних, а затем и передних конечностей, после чего наступает гибель животного. У павших животных исследуют головной мозг на наличие телец Бабеша-Негри, в РИД и РИФ. По результатам биопробы ставят окончательный диагноз.

Ретроспективную серодиагностику бешенства не применяют вследствие значительной сероконверсии вируса и высокой смертностью больных животных, а характер изменения титра антител исследуют только для оценки поствакцинального иммунитета. В мировой практике при осуществлении международной торговли животными проводят диагностику инфекции реакцией нейтрализации в культуре клеток или твердофазным ИФА.

ЛЕКЦИЯ 2. ВИРУСЫ ГРИППА, ПАРАГРИППА-3, ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА

Грипп животных - высококонтагиозная остро протекающая болезнь, характеризующаяся внезапным началом, резко выраженной лихорадкой, конъюнктивитом, поражением дыхательной системы (прежде всего верхних дыхательных путей), при более тяжелом течении – пневмонией.

Грипп кур (классическая чума птиц) – острая контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся общим угнетением, отеками, поражением органов дыхания и пищеварения.

Все вирусы гриппа относят к семейству Orthomyxoviridae, включающему три рода – род вирусов гриппа А, В и С. Возбудителем гриппа животных является исключительно род А. Возбудитель гриппа представляет собой РНК-геномный вирус, содержащий минус-нить РНК. Вирион является сложным комплексом антигенов, которые по локализации делят на внутренние и наружные. Вирусы гриппа А содержат общий внутренний антиген, отличающийся в антигенном отношении от такового у других родов. Внутренние антигены вирусов гриппа всех родов выявляют в РСК, поэтому данная серологическая реакция используется в лабораторной практике определения родовой принадлежности изолированного вируса.

Наружными антигенами являются белки двух типов: гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N). Субъединица Н вызывает гемагглютинацию эритроцитов различных видов животных. При температуре 4-22ºС вирусы гриппа способны гемагглютинировать эритроциты более 22 видов животных, но в практике чаще используют человека (группа О), кур, морских свинок. Нейраминидаза придает вирусу способность проникать через слизистые оболочки верхних дыхательных путей. Антигены Н и N являются неоднородными в пределах рода А. До настоящего времени установлено наличие 15 вариантов гемагглютинина (1-15) и 9 вариантов нейраминидазы (1-9), что дает возможность разделять вирусы гриппа на серологические разновидности (сероварианты). Различное сочетание разных типов Н и N позволило идентифицировать более 50 сероваров вируса гриппа А. При этом основная их масса обнаружена у птиц.

Патматериал для исследования получают путем протирания носовых ходов стерильными ватными тампонами, которые сразу же после извлечения погружают в пробирки с раствором Хенкса. Кроме того, материал можно получать введением в каждый носовой ход 10 мл физиологического раствора и извлечением смывной жидкости в пробирки. Носовые смывы берут от 3-4 больных животных с явными клиническими признаками в первые 5-6 дней болезни. От павших животных отбирают кусочки легких и трахеи размером до 5 см в диаметре и отправляют в охлажденном или замороженном виде.

Подготовка патматериала. В лаборатории полученный жидкий материал (смывы со слизистых) оттаивают при комнатной температуре, тампоны отмывают в растворе Хенкса. Полученную жидкость центрифугируют при 1000-2000 тыс об/мин для осаждения крупнодисперсных частиц, добавляют антибиотики по общей методике, оставляют для контакта в холодильнике или при комнатной температуре на 1-2 часа. Подготовленный таким образом материал используют для заражения развивающихся куриных эмбрионов.

Лабораторная диагностика гриппа проводится по двум направлениям:

- выделение вируса на чувствительных тест-объектах с последующей его индикацией и идентификацией;

- выявление специфических антител в крови у переболевших животных (ретроспективная диагностика).

Первое направление исследования используется при первичной постановке диагноза на болезнь в благополучных хозяйствах, второе – для выяснения эпизоотической обстановки по заболеванию (наличие циркуляции вируса среди животных хозяйства).

Выделение вируса гриппа проводят на развивающихся куриных эмбрионах. Заражение проводят в аллантоисную или амниотическую полость 9-12 суточных эмбрионов, которых затем инкубируют в течение 48-72 часов, иногда 96 часов при 37ºС. Введение исследуемого материала в амниотическую полость является более чувствительным способом. В обоих случаях заражения вирулентным вирусом гриппа А при вскрытии на теле эмбрионов обнаруживают геморрагии. Присутствие вируса гриппа А подтверждают постановкой РГА с экстраэмбриональными жидкостями.

Идентификацию вируса гриппа проводят в РТГА с использованием штаммоспецифических сывороток против вируса гриппа рода А. По результатам реакции определяют присутствие вируса гриппа А в материале. Положительным результатом лабораторного исследования является выделение вируса гриппа из патматериала с последующей его идентификацией в РТГА.

Серологическая диагностика заключается в выявлении специфических антител в крови переболевших животных с целью определения благополучия поголовья по гриппу. Для этого отбирают кровь от 10-20 животных от каждой группы. Интервал между пробами должен составлять не менее 8-14 дней. Сыворотки перед исследованием обязательно прогревают при 60ºС в течение 30-ти минут, обрабатывают углекислым газом (СО₂) для удаления термостабильных ингибиторов и добавляют эритроциты кур для удаления неспецифических агглютининов. Наличие антител устанавливают в РТГА с использованием эталонных штаммов вируса гриппа А. Выявление 4-кратного и более нарастания титра антител в парных пробах сыворотки крови свидетельствует о переболевании животного гриппом.

Инфекционный ринотрахеит - остро протекающая контагиозная болезнь крупного рогатого скота, характеризующаяся преимущественно катарально-некротическими поражениями дыхательного тракта, лихорадкой, общим угнетением и конъюнктивитом, а также развитием пустулезного вульвовагинита при попадании вируса в половые органы животного и абортами.

Возбудителем инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота является вирус из семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae, рода Varicellavirus. Это ДНК-геномный вирус, в капсид которого входит 33 структурных белка, многие из которых участвуют в качестве антигена в иммунологических реакциях. Наибольшей иммуногенностью обладают два белка, обозначаемых как VP74 и VP90, последний из которых, кроме того, функционально является гемагглютинином и способен агглютинировать эритроциты белых мышей. Вследствие изменчивости белков вирус ИРТ дифференцируют на подтипы 1.1., 1.2а, 1.2b и 5, последний из которых обладает значительным нейротропизмом. Однако в большинстве случаев клиническая патология обусловлена подтипом 1.1.

Вирусы ИРТ, как и все герпесвирусы, реплицируются в ядре, образуют там внутриядерные включения, что является характерной особенностью всех герпесвирусов. Вирус болезни так же, как и все герпесвирусы, обладает способностью длительно персистировать внутри организма. Вирус в период латентной инфекции сохраняется в нейронах сенсорных ганглиев спинномозговых нервов, причем ее длительность может достигать 19 месяцев. Аналогичное явление наблюдают при введении вакцинных ослабленных (аттенуированных) штаммов возбудителя. Активизация вируса и переход болезни в острую форму происходят при снижении резистентности организма, а также при применении некоторых лекарственных веществ, в частности кортикостероидов.

Отбор и подготовка материала. В лабораторию направляют патматериал, взятый в первые 2-3 дня болезни при выраженной клинической картине или от животных, убитых с диагностической целью в острой стадии болезни. От больных животных берут 15-20 проб: смывы с пораженных слизистых оболочек, сперму. После этого тампоны с материалом помещают в стерильные пенициллиновые флаконы или пробирки с 2-3 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса, содержащего от 500 до 1000 ЕД / мл антибиотиков. От убитых животных берут кусочки легких с бронхом, селезенки, регионарные лимфоузлы, пораженные участки слизистой ротовой и носовой полостей, миндалины, от абортированных плодов – кусочки паренхиматозных органов. Кусочки материала массой до 20 г помещают в стерильную посуду.

Лабораторную диагностику инфекционного ринотрахеита можно проводить по двум направлениям:

- первичное обнаружение вируса в патматериале в РИФ, ИФА с подтверждением диагноза путем выделения вируса и его идентификацией;

- обнаружение специфических антител в крови больных животных в РНГА, РН или ИФА (ретроспективная диагностика).

Обнаружение вируса в патматериале проводят вирусоскопическим методом, основанным на обнаружении вирусного антигена в мазках, отпечатках или гистосрезах из доставленного материала методом иммунофлуоресценции. Для этого из патологического материала от убитого животного готовят препараты-отпечатки или гистосрезы на 4 обезжиренных стеклах по 3 мазка на стекле (всего 12 отпечатков). Со слизистых оболочек и конъюнктивы делают мазки. После фиксации препаратов в охлажденном ацетоне (минус 10-20ºС) в течение 20-30 минут его обрабатывают флуоресцирующими сыворотками и микроскопируют. При этом обращают внимание на свечение вирусного антигена в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповрежденных клеток. Ярко-зеленая флуоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз на ИРТ ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб.

Первичное обнаружение вируса в патматериале можно также проводить иммунопероксидазным методом ИФА. С этой целью исследуют прижизненно взятые назофарингиальные мазки-отпечатки.

Выделение вируса инфекционного ринотрахеита осуществляют в монослое клеток почек телят (ПТ) и эмбрионов коровы (ПЭК). Цитопатогенное действие вируса ИРТ в культуре клеток характеризуется образованием окон в монослое, округлением клеток, скоплением их в виде «гроздьев» с последующим отслоением их от поверхности стекла.

Идентификацию вируса осуществляют в РН. Реакцию нейтрализации проводят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК. При положительных результатах РН вирус считают полностью идентифицированным.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика основана на выявлении специфических антител ИРТ в крови больных и переболевших животных в РНГА или РН. Для постановки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток крови, взятых в интервале 3 недель. Результат серодиагностики учитывают по возрастанию титра антител в парных пробах сывороток крови, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал. Перед исследованием все пробы сывороток прогревают в водяной бане при 56ºС в течение 30 минут.

РНГА проводят с использованием промышленно выпускаемого эритроцитарного диагностикума. Результаты РНГА оценивают по титрам антител: положительные – 1:16 и выше, сомнительные – 1:8, отрицательные – 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титра антител в парных пробах в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции.

Парагрипп-3 крупного рогатого скота – остро протекающая контагиозная болезнь, главным образом, телят, характеризующаяся поражением органов дыхания различной тяжести - от легких ринитов и бронхитов до тяжелой бронхопневмонии. У взрослых животных наблюдают бессимптомную латентную инфекцию без признаков поражения дыхательной системы. У стельных коров инфекция может привести к внутриутробному заражению плода, абортам или мертворождениям.

Возбудителем парагрипа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота является вирус семейства Paramyxoviridae, рода Paramyxovirus. Кроме этого возбудителя род также включает возбудителей паротита человека, парагриппа человека, обезьян, грызунов, а также ньюкаслской болезни.

Геном возбудителя представлен минус-нитью РНК. На поверхности вириона присутствует гликопротеин, обладающий одновременно гемагглютинирующей и нейраминидазной активностью (NH).

Внутренний белковый компонент вириона – рибонуклеопротеид – обладает антигенной активностью и способен выявляться в РСК. Однако РСК в ветеринарии не нашло широкого применения из-за сложности выделения из вириона внутреннего антигена. Поверхностный структурный белок гемагглютинин-нейраминидазный гликопротеин, являясь антигеном, выявляется в РТГА. Все штаммы вируса ПГ-3 в антигенном отношении являются однородными, поэтому антигенной вариабельности среди вирусов ПГ-3 не выявлено.

Лабораторную диагностику ПГ-3 всегда проводят параллельно с исследованием материала на аденовирусную инфекцию, респираторно-синцитиальную инфекцию, инфекционный ринотрахеит и вирусную диарею из-за сходства их клинических признаков (группа заболеваний, называемых пневмоэнтеритами).

Отбор патматериала. В лабораторию направляют материал от больных животных, взятый в течение первых 2-3 дней болезни при выраженной клинической картине или от животных, убитых с диагностической целью в острой стадии болезни.

От больных берут 15-20 проб следующего материала:

- смывы со слизистой оболочки носовой полости путем введения стерильного ватно-марлевого или поролонового тампона в носовые ходы;

- смывы с конъюнктивы;

- смывы со слизистой оболочки прямой кишки.

От животных, убитых с диагностической целью, берут кусочки легких и бронхов (на границе пораженных и здоровых участков), селезенки, лимфоузлов. Кусочки материала массой до 20 г помещают в стерильную посуду, которую помещают в термос со льдом. Если доставка материала в течение одних суток невозможна, то материал консервируют более низкой температурой – минус 20-30ºС.

Подготовку материала для исследования проводят по общей схеме. Она включает центрифугирование жидкого материала при 1000 об/мин в течение 10-15 минут, обработку надосадочной жидкости антибиотиками. В дальнейшем надосадочную жидкость используют для выделения вируса, а осадок дважды промывают физиологическим раствором с последующим нанесением небольшого количества материала на предметные стекла (получение мазков из патматериала).

Лабораторная диагностика ПГ-3 может проводиться по следующим направлениям:

- обнаружение вируса в патологическом материале методом РИФ;

- выделение возбудителя на культурах клеток и его идентификация;

- выявление специфических антител в крови животных.

Обнаружение вируса в патматериале осуществляют путем постановки РИФ. Необходимо иметь в виду, что вирус ПГ-3 чаще всего может быть обнаружен в эпителиальных клетках носовых ходов и ротоносоглотки, а также легких, поэтому исследуют в РИФ мазки, приготовленные из этих органов по вышеописанной методике. После приготовления мазки высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном (минус 10-20°С) ацетоне в течение 20-30 минут, после чего обрабатывают флюоресцирующими сыворотками из диагностического набора для диагностики ПГ-3. После обработки в течение 45 минут в условиях влажной камеры и 37ºС препарат исследуют в люминесцентном микроскопе. В положительном случае вирус обнаруживают в цитоплазме пораженных клеток.

Выделение вируса. Наиболее часто для выделения используют первичные субкультуры: ПЭК, ЛЭК, ПТ, ТБ. Цитопатическое действие, вызываемое вирусом ПГ-3, характеризуется образованием синцития и вакуолей.

Одновременно с выявлением ЦПД, начиная с 3-5 дня после заражения, проводят РГАд с целью обнаружения присутствия гемагглютинирующего вируса. Для постановки РГАд используют 0,5%-ную взвесь эритроцитов морской свинки. При обнаружении ЦПД и феномена гемадсорбции проводят параллельное культивирование зараженных материалом культур клеток на предметных стеклах, которые через 18-24 часа исследуют в РИФ по вышеописанной методике. Обнаружение специфического ЦПД, феномена гемадсорбции в зараженных культурах клеток и получение положительного результата РИФ дает основание предполагать присутствие вируса ПГ-3 в материале.

Идентификацию вируса проводят серологическими реакциями - РТГАд, РТГА. Последнюю применяют для типирования выделенного на культуре клеток гемадсорбирующего вируса. В реакции возможно использование только эритроцитов морских свинок, гусей и индюков. При этом гемагглютинация наступает через 60-90 минут, 1-3 минуты и 2-5 минут соответственно. Иммунные сыворотки, используемые в РТГА, обязательно должны быть освобождены от ингибиторов путем прогрева при 56ºС в течение 30 минут и обработаны каолином или фильтратом холерного вибриона.

Ретроспективная серодиагностика основана на выявлении специфических антител в крови животных. При этом оценивают динамику изменения титра антител в парных пробах сыворотки крови, взятых в начале болезни (не позднее 4-5 дня) и повторно через 2-3 недели. Выявление антител проводят в серологических реакциях РТГА, РТГАд, однако первой отдается предпочтение.

Положительным результатом считают 4-кратное и более увеличение титра антител при исследовании парных проб сывороток крови или носовых секретов.