Лекция 4. Вирусы оспы млекопитающих и птиц. Вирус лейкоза крупного рогатого скота

Оспа млекопитающих и птиц – острая контагиозная болезнь, протекающая с характерными стадийными поражениями кожи различных участков тела и слизистых оболочек.

Особенностью патологических изменений при оспе является их стадийность: розеола (локальное покраснение участка кожи), папула (уплотнение участка кожи за счет клеточной инфильтрации), везикула (наполнение его везикулярной серозной жидкостью), пустула (переход серозного воспаления в гнойное) и круста (появление корочек на месте поражения). У птиц, кроме того, выделяют дифтеритическую форму с фибринозным поражением слизистой оболочки носовой и ротовой полостей.

Возбудителями оспы животных являются вирусы из семейства Poxviridae, подсемейства Chordopoxvirinae различных родов: Orthopoxvirus – возбудители оспы у коров, человека, лошадей, кроликов и др., Avipoxvirus – птиц (прежде всего кур), Capripoxvirus – овец и коз, Suipoxvirus – свиней, Leporipoxvirus – вирусы миксомы и фибромы кроликов, Parapoxvirus – параоспенные вирусы. Вирусы различных родов отличаются по биологическим свойствам, главным из которых является спектр патогенности – первый из названных считается полиэтиологическим, то есть способным вызывать оспу у широкого спектра хозяев.

Все оспенные вирусы являются ДНК-геномными и содержат в составе вириона фермент для собственной транскрипции. В этой связи все вирусы данного семейства, не нуждаясь в клеточных ферментах транскрипции, реплицируются в цитоплазме клеток. Другими отличительными особенностями вирусов оспы является их большой размер, сопоставимый с размерами мельчайших бактерий, и они могут быть обнаружены световой вирусоскопией. Для вирусов оспы характерно наличие сложного типа симметрии, который обусловлен присутствием двух дополнительных структур, входящих в состав вириона. Они представляют собой мембраны, наружная из которых большей толщины и имеющая большое количество полых винтообразных филаментов. Нуклеоид в центре вириона имеет характерную двояковогнутую форму. Все вышеотмеченные особенности строения придают зрелому вириону оспы характерную кирпичеобразную форму (обнаруживается в электронном микроскопе).

Вирусы млекопитающих довольно сложно культивировать в лабораторных условиях: на ХАО развивающихся куриных эмбрионов они с трудом культивируются после предварительной адаптации с образованием характерных оспин, способны репродуцироваться в культурах клеток почек и тестикул эмбриона. Лучшим объектом для культивирования вирусов оспы млекопитающих являются естественно восприимчивые животные.

В антигенном отношении различные вирусы оспы млекопитающих идентичны в пределах родов. В основном вирусы оспы млекопитающих гемагглютинирующими свойствами не обладают; вирусы оспы птиц способны агглютинировать эритроциты кур отдельных пород, однако РТГА и РГА в практике используют очень редко.

Диагноз на оспу ставят клиническим методом, однако для его подтверждения проводят лабораторное исследование.

Отбор патматериала. Для исследования берут содержимое везикул и пустул, поверхность которых предварительно очищают ватным тампоном, смоченным в эфире или спирте. Прокол и отбор везикулярной жидкости проводят с помощью пастеровской пипетки, после чего конец ее запаивают. Папулы соскабливают скальпелем. Патологический материал должен быть доставлен в лабораторию в замороженном или охлажденном (4-6ºС) виде. Также его допускается консервировать в 10%-ном растворе глицерина.

Одновременно с отбором патматериала на месте готовят мазки из везикулярной и пустулезной жидкости для последующего вирусоскопического исследования. Для этого поверхности везикул или пустул осторожно срезают бритвой и внутренней поверхностью среза однократным движением проводят по предметному стеклу. После приготовления мазки высушивают на воздухе.

Также отбирают материал из измененных участков кожи на границе с неизмененной для гистологического исследования, который помещают в 10%-ный раствор формалина.

Подготовка материала заключается в получении суспензии для заражения животных. Готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе, после чего ее центрифугируют при 2 тыс об/мин в течение 15 мин. Затем к надосадочной жидкости добавляют 500 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина, 50 ЕД/мл нистатина и выдерживают 12 часов при 4ºС.

Лабораторная диагностика оспы заключается в:

- обнаружении возбудителя в мазках методом световой микроскопии;

- постановке биопробы на животных (в случае получения отрицательного или сомнительного результата первого метода).

Обнаружение вируса в патматериале осуществляют методом световой вирусоскопии препаратов-отпечатков, окрашенных по Морозову. В положительном случае в мазках из пораженных участков кожи обнаруживают характерно расположенные вирионов в виде россыпи.

Одновременно с обнаружением элементарных телец параллельно проводят гистологическое исследование материала из пораженных участков. При этом обнаруживают цитоплазматические оксифильные (оспа овец и коз) или ацидофильные (оспа свиней) включения, внутриядерные вакуоли, гиперплазию эпидермиса кожи.

Положительный результат вирусоскопического исследования дает основание на постановку окончательного диагноза на оспу. При получении сомнительного или отрицательного результатов вирусоскопии проводят постановку биопробы на естественно восприимчивых животных.

Биопроба в диагностике оспы млекопитающих заключается в заражении естественно восприимчивых животных, причем выбор объекта заражения зависит от вида животных, у которых диагностируют болезнь. В качестве тест- объекта для постановки биопробы используют молодых неиммунных овец и коз, поросят 2-3- месячного возраст или кроликов. Экспериментальных животных заражают внутрикожно в бесшерстную поверхность хвоста в дозе 0,1-0,15 мл (овцы, козы) или путем скарификации надосадочной жидкостью в объеме 0,6 мл в кожу живота (свиньи) или на поверхность роговицы глаза (кролик). Биопробу считают положительной в случае развития на месте введения местного оспенного процесса через 6-8 дней. Специфичность патологического процесса в ходе постановки биопробы подтверждают вирусоскопическим исследованием мазков, приготовленных из срезанного оспенного узелка.

Кроме вирусоскопического метода в практике рекомендовано использование РИД для обнаружения вирусного антигена в патматериале.

Серодиагностику и ретроспективную диагностику оспы проводят редко.

Лабораторная диагностика оспы птиц. Для исследования в лабораторию направляют свежие оспенные поражения с лицевой части головы (гребень, бородки, сережки) или свежие дифтеритические поражения гортани и трахеи. Одновременно с отбором патматериала для вирусологического исследования готовят мазки из пораженных участков для вирусоскопического исследования. Фиксацию мазков проводят на месте, помещая их в смесь спирта и эфира на 3 мин.

Лабораторная диагностика оспы птиц включает:

- обнаружение вирионов в мазках из патматериала;

- выделение вируса на РКЭ и курах с последующей его идентификацией;

- выявление специфических антител в крови переболевшей птицы.

Обнаружение вирионов оспы птиц (элементарные тельца Борреля) проводят при исследовании вирусоскопическим методом мазков, окрашенных по Морозову. Параллельно с обнаружением вирионов оспы исследуют мазки, получаемые путем раздавливания оспенных поражений между двумя стеклами и окрашенные суданом III в течение 10-15 мин. В положительных случаях обнаруживают специфические тельца-включения (тельца Боллингера) в цитоплазме клеток.

Выделение вируса оспы птиц осуществляют путем заражения 10%-ной суспензией, свободной от микрофлоры, развивающихся куриных эмбрионов. Для этого предварительно готовят разведения суспензии (10^-2 и 10^-3) и заражают четырех эмбрионов на ХАО в объеме 0,2 мл. Погибшие эмбрионы на 3-е сутки, а также выжившие на 6-е сутки охлаждают и вскрывают. В положительных случаях на ХАО обнаруживают отдельно расположенные или слившиеся оспины.

Выделение вируса оспы птиц также осуществляют путем постановки биопробы на курах 3-4- месячного возраста, которых заражают путем втирания суспензии в скарифицированную поверхность гребня, бородок, а также свободные от перьев фолликулы голени. Специфичность оспенных поражений у экспериментально зараженной птицы подтверждают вирусоскопическим методом.

Идентификацию вируса проводят в РИД или РИФ. Указанные серологические реакции могут также быть использованы для обнаружения и идентификации вируса непосредственно в патматериале.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика оспы птиц заключается в обнаружении специфических антител реакцией иммунодиффузии в агаровом геле. Антигеном в реакции служат хорион-аллантоисные оболочки, собранные на 4-5-й день после заражения развивающихся куриных эмбрионов.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, при которой происходит злокачественное размножение клеток кроветворных органов, в результате чего наблюдается диффузная инфильтрация внутренних органов инфицированными клетками. Лейкоз в основном встречается у взрослых животных, наиболее часто в возрасте 5-8 лет. При этом развитие болезни характеризуется стадийностью: инкубационный период, бессимптомная стадия (серологическая), гематологическая и опухолевая. Инкубационный период при лейкозе варьирует в больших временных промежутках. На клеточном уровне представляет собой период инфекции после заражения до появления антител. В этот период происходит инфицирование лимфоцитов и нахождение провируса в интегрированном состоянии.

Серологическая стадия характеризуется выработкой антител со стороны организма и продолжается до момента начала усиленного размножения инфицированных лимфоцитов. При опухолевой стадии происходит инфильтрация внутренних органов инфицированными лимфоцитами – диффузно или локально с появлением опухолей. При этом в патологический процесс может вовлекаться костный мозг или лимфоидная ткань, что дало возможность разделять две группы лейкозов. В связи с тем, что неопластической трансформации подвержены различные популяции лимфоцитов, выделяют несколько форм лейкозов. К первой группе лейкозов (с локализацией патологического процесса в костном мозге) относят лимфоидный, миелоидный, слабодифференцированный и недифференцированный лейкозы. К болезням второй группы (с локализацией патологического процесса в лимфоидной ткани) относят лимфосаркому, ретикулосаркому и лимфогранулематоз.

Возбудителем лейкоза КРС является вирус из семейства Retroviridae рода Deltaretrovirus. Все вирусы, входящие в данное семейство, имеют в составе вириона фермент - обратную транскриптазу - обеспечивающий синтез молекулы ДНК на молекуле РНК. Другой отличительной особенностью ретровирусов является их репликация через стадию образования двунитчатой молекулы ДНК (провирус) на вирусной РНК при участии вышеотмеченного фермента с последующей ее интеграцией в клеточный геном клетки-мишени. Созревание вирионов происходит путем почкования на клеточных мембранах, чаще без разрушения клеток-хозяев.

В жизненном цикле вируса лейкоза КРС (ВЛКРС) выделяют две его формы: эндогенную и экзогенную. Первая из них представляет собой интегрированный вирусный геном в геном клетки (состояние провируса). Распространение эндогенной формы вируса в организме животного происходит при делении инфицированной клетки и представляет собой передачу вирусного генетического материала дочерним клеткам. Данный путь распространения называется вертикальным неинфекционным путем распространения. Экзогенный онковирус представляет собой зрелую вирусную частицу, распространяющуюся горизонтальным путем (от животного к животному) и вертикальным инфекционным, который в отличие от вертикального неинфекционного характеризуется заражением половых клеток или клеток эмбриона от матери.

В составе вириона присутствуют несколько групп белков, наиболее важными из которых в антигенном отношении является внутренний вирионный белок р24, а также наружный структурный гликопротеин gp51. На наличие внутреннего антигена в организме формируются преципитирующие антитела, а поверхностного гликопротеидного антигена – вируснейтрализующие антитела. Клеткой-мишенью для ВЛКРС является В-лимфоцит, реже – Т-лимфоцит, в геном которых одновременно интегрируется около трех копий ДНК-провируса Провирус изменяет экспрессию клеточных генов, в частности onc гена, вблизи которого происходит интеграция вирусной нуклеиновой кислоты. В результате активизации onc гена начинается усиленное размножение лимфоцитов (трансформация). Кроме того, провирус способен длительно персистировать в организме в интегрированном состоянии. В этом виде вирус обычно защищен от действия антител. Защита организма от инфицирования обусловлена выработкой на поверхностные вирионные гликопротеиды (главным образом gp51) вируснейтрализующих антител. Однако даже при их наличии возможно сохранение и размножение вируса в лимфоцитах, инфильтрирующих ткани в местах, не доступных для действия противовирусных антител.

Лабораторная диагностика лейкоза КРС включает в себя серологическое, гематологическое и гистологические исследования.

Отбор патматериала. Для гематологического исследования берут пробы крови из яремной вены, стабилизированные 10%-ным раствором ЭДТА из расчета 0,02 мл (1 капля) на 1 мл крови. Для гематологического исследования отбирают пробы крови от животных старше 2 лет. Не разрешается брать кровь от животных 15 дней до отела и 15 дней после него.

Для серологического исследования отбирают пробы сывороток крови от животных старше 6-месячного возраста. При этом в лабораторию направляют 5-6 мл сыворотки в термосе со льдом. Для гистологического исследования отбирают пробы пораженных органов и посылают в свежем виде в термосе со льдом или консервируют 10%-ным формалином.

Серологический метод заключается в постановке РИД в агаровом геле, с помощью которой выявляются противолейкозные антитела в сыворотке крови. Животных, сыворотки которых дали положительный результат в РИД, считают инфицированными вирусом лейкоза, после чего их дополнительно исследуют гематологическим методом.

Гематологический метод основан на обнаружении в периферической крови повышенного количества лейкоцитов, главным образом, лимфоидного ряда и слабо дифференцированных клеток.

Повышенное количество лейкоцитов устанавливается путем их подсчета в камере Горяева после обработки крови жидкостью Тюрка по обычной методике. При обнаружении лейкоцитоза из этой же пробы крови готовят мазок на стекле, окрашивают одним из методов (по Романовскому-Гимзе, Паппенгейму, Нохту) и выводят лейкограмму. После этого высчитывают абсолютное число лимфоцитов в крови путем умножения количества лейкоцитов на процент лимфоцитов в лейкограмме. Интерпретацию результатов проводят с использованием лейкозного ключа.

Гистологический метод является вспомогательным в диагностике лейкоза и основан на обнаружении инфильтрации внутренних органов лимфоцитами различных популяций. Гистологический метод дает возможность дифференцировать различные формы лейкоза.

Животное считается больным лейкозом при наличии:

- положительного результата однократного гематологического исследования;

- клинических признаков болезни;

- положительного результата гистологического исследования патологического результата.