2018-01-21
1309
Ньюкаслская болезнь – высококонтагиозная вирусная болезнь, главным образом куриных, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом, геморрагическим диатезом и поражением внутренних органов.
Из-за сильного разнообразия симптомов болезни различают четыре ее формы. Первая форма вызывается велогенными штаммами вируса и характеризуется одновременным поражением органов дыхания и пищеварения (в виде геморрагического поражения пищеварительного тракта), параличами конечностей и 100%-ной летальностью. Вторая форма протекает аналогично, но без поражения органов пищеварения (пневмоэнцефалитная форма). Третья форма характеризуется поражением только дыхательной системы, и вызывается мезогенными штаммами вируса (респираторная форма). Четвертая форма вызывается лептогенными штаммами вируса и сопровождается незначительными изменениями респираторного и герминативного тракта.
Возбудителем ньюкаслской болезни является вирус из семейства Paramyxoviridae, рода Rubulavirus (Avulavirus). У птиц выделяют 9 различных серотипов парамиксовирусов, однако возбудитель ньюкаслской болезни, обозначенный как серотип 1, является серологически обособленным, лишь обладая некоторым антигенным родством с серотипами 3 и 7.
|
|
|
Характерной особенностью вируса ньюкаслской болезни является его различие в патогенности различных штаммов, причем определенная степень патогенности является стабильной и наследуемой в пределах популяции. Различают высокопатогенные штаммы вируса (велогенные штаммы), среднепатогенные (мезогенные) и слабопатогенные (лептогенные). В целом выделяют висцеротропные велогенные штаммы, вызывающие болезнь с геморрагическим поражение желудочно-кишечного тракта; нейротропные велогенные, вызывающие болезнь с респираторными и нервными поражениями; мезогенные, вызывающие болезнь с низкой летальностью и поражением дыхательной системы; лептогенные (респираторные), болезнь от которых характеризуется слабыми клиническими признаками в дыхательной системе и асимптомные кишечные, вызывающие субклиническую форму болезни.
Последние при заражении вызывают у птиц слабую или инаппарантную форму болезни с формированием полноценного иммунитета, поэтому некоторые природные лептогенные штаммы вируса ньюкаслской болезни (La Sota, Бор-73, B1, F) часто используют для иммунизации в качестве живых вакцин. Слабая патогенность лептогенных штаммов вируса болезни обусловлена присутствием в их составе видоизмененного структурного белка F0, не способного трансформироваться в полноценный белок F1. В этой связи авирулентные штаммы вируса проходят в чувствительных клетках цыплят только один цикл репродукции, после чего новой популяции вирусов не образуется.
|
|
|
Вирион ньюкаслской болезни имеет в своем составе несколько белков, одним из которых является гемагглютинин-нейраминидаза (HN), который обусловливает гемагглютинирующую активность в отношении эритроцитов птиц, человека, белой мыши, морской свинки. Гемагглютинирующая активность белка NH разных штаммов ньюкаслской болезни отличается по чувствительности, по температурному воздействию и спектру активности. Как правило, гемагглютинины лептогенных штаммов являются термолабильными при 56˚С в отличие от велогенных штаммов, но обладают более широким спектром активности – способны агглютинировать, кроме того, эритроциты лошади, овец и кошек. Хотя поверхностный белок HN обладает некоторой антигенной изменчивостью, все выделяемые штаммы вируса ньюкаслской болезни различной патогенности в антигенном отношении сходны.
Таким образом, вирулентные велогенные штаммы вируса могут быть отличены от низковирулентных штаммов по следующим критериям:
1. Способностью распространяться во многие ткани РКЭ после заражения, в то время как авирулентные обладают узкой тканевой специфичностью.
2. Способностью вызывать выраженное цитопатическое действие на культурах клеток в виде бляшек в отличие от слабовирулентных.
3. Различной патогенной активностью в отношении куриных эмбрионов: велогенные штаммы вызывают их гибель через 32-60 часов, мезогенные – через 60-90 часов, лептогенные – более 100 часов.
4. Термостабильностью гемагглютининов велогенных штаммов в отличие от лептогенных (при 56˚С).
Отбор патматериала. Вирус в зависимости от вирулентности и тропизма можно выделить из различных органов (головной мозг, костный мозг, трахея, кишечник, селезенка и др.), поэтому для исследования рекомендуется брать голову, легкие, трахею, селезенку, печень от только что павших или вынужденно убитых птиц. Патматериал необходимо брать только в начале вспышки болезни (в первые 3-5 дней), так как по мере ее развития концентрация вируса резко снижается. Сразу после отбора материал отправляют в лабораторию в термосе со льдом. Допускается консервирование патматериала в стерильном 50%-ном глицерине. Пробы крови для серологического исследования получают путем прокола подкрыльцовой вены или убоя цыплят (5-10) из каждой исследуемой группы. Повторное взятие крови проводят через 15-20 дней.
Подготовка материала включает приготовление суспензии для заражения тест-объектов и препаратов-отпечатков для исследования в РИФ. Суспензию из внутренних органов (1:10) готовят на фосфатно-буферном растворе или МПБ с рН 7,2, после чего центрифугируют 15 минут при 2-3 тыс об/мин. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (по 1000 ЕД/мл пенициллина и 1000 мкг стрептомицина) в течение 30-60 минут при комнатной температуре. Препараты-отпечатки готовят из печени, почек и селезенки на предметном стекле. При этом мазки должны быть тонкие и ровные, площадью не более 0,8 х 0,8 см по три отпечатка каждого кусочка органа на отдельном стекле. После высушивания на воздухе препараты фиксируют охлажденным ацетоном в течение 4-10 минут.
Лабораторная диагностика проводится по следующим методам:
- первичное обнаружение вируса в патматериале;
- выделение, индикация и идентификация вируса;
- обнаружение антител в сыворотке крови птиц.
Первичное обнаружение вируса в патматериале проводят путем исследования приготовленных препаратов-отпечатков в РИФ. Для обнаружения специфических антигенов применяют гомологичные антитела, меченные РСХ (родаминсульфахлоридом). Использование ФИТЦ-конъюгатов не приемлемо, так как ткани птицы обладают собственной аутофлуоресценцией зеленого цвета. В положительных случаях вирусный антиген обнаруживают в ядрах клеток лейкоцитов или пораженных клеток органов в виде яркой флуоресценции оранжево-красного цвета.
|
|
|
Выделение вируса осуществляют путем заражения РКЭ 9-11-дневного возраста в аллантоисную полость суспензией материала в объеме 0,2 мл. При этом на каждую пробу материала используют не менее 10 эмбрионов. Инкубацию зараженных эмбрионов проводят в течение 72 часов, после при отсутствии погибших 5 эмбрионов убивают путем охлаждения при 4ºС на ночь. Остальные пять эмбрионов инкубируют до 120 часов, а затем убивают. При этом учитывают срок наступления гибели и по времени гибели эмбрионов определяют вирулентность изолированного штамма.
При отсутствии РКЭ вирус можно выделить на неиммуннной к ньюкаслской болезни птице. Для этого исследуемый материал вводят (0,5мл) внутримышечно цыплятам в возрасте 2-4 мес. При появлении для болезни симптомов птицу убивают в агональном состоянии и берут пробы головного мозга и селезенки для индикации и идентификации вируса.
Индикация вируса в выделенном материале необходима для ориентировочного определения гемагглютинирующего вируса в аллантоисной или амниотической полостях, а также органах вскрытого куриного эмбриона. Для быстрой индикации вируса ставят РГА с эритроцитами кур, морской свинки и обязательно лошади. Постановка РГА с эритроцитами лошади позволяет дифференцировать вирус гриппа птиц в изоляте, который в отличие от вируса ньюкаслской болезни способен их агглютинировать. Для постановки реакции на предметные стекла наносят 5%-ную суспензию эритроцитов и каплю вируссодержащего материала и наблюдают за появлением хлопьев эритроцитов.
Идентификацию вируса ньюкаслской болезни осуществляют в РТГА макро- и микровариантов. Постановка РТГА микрометодом заключается в нанесении на предметное стекло аллантоисной жидкости, содержащей идентифицируемый гемагглютинирующий вирус, капли эталонной специфической сыворотки и капли суспензии эритроцитов. Идентификацию вируса также можно проводить в РИФ по вышеописанной методике, ИФА, РСК. При постановке последней следует иметь в виду, что патогенные велогенные штаммы вируса обладают слабой комплементсвязывающей активностью в отличие от мезо- и лептогенных штаммов.
|
|
|
Серодиагностика и ретроспективная диагностика ньюкаслской болезни основана на выявлении специфических антител к возбудителю болезни.
В практике используют РТГА, в которой исследуют парные пробы сыворотки крови в присутствии эталонного антигена (в его качестве используют вакцинный штамм La Sota). Результат реакции считают положительным, если разница в титрах первой и второй сывороток составляет не менее трех разведений. Для оценки поствакцинального иммунитета также исследуют желтки яиц от вакцинированной птицы, что имеет некоторые преимущества перед исследованием сывороток крови птиц серологическим методом.
Инфекционный бурсит (болезнь Гамборо, инфекционная бурсальная болезнь) – остро протекающая болезнь, поражающая чаще всего цыплят 3-6-недельного возраста и характеризующаяся поражением клеток и органов иммунной системы, в первую очередь – фабрициевой бурсы.
Болезнь может протекать в двух формах: острая форма наблюдается у цыплят старше 3-недельного возраста – она характеризуется диарей, апатией, вторичным нефрозом, поражением фабрициевой бурсы, внутримышечными геморрагиями. У цыплят моложе 3-недельного возраста и не содержащих материнских антител инфицирование приводит к иммунодепрессии и развитию вторичных инфекций. Наиболее чувствительны к возбудителю куры и индюшата, у которых болезнь вызывается другим серотипом вируса. Также возможна болезнь у утят, хотя патогенность возбудителя к ним низкая.
Возбудителем инфекционного бурсита птиц является вирус из семейства Birnaviridae, рода Avibirnavirus. Геном вируса представлен двуспиральной линейной фрагментированной на два фрагмента молекулой РНК. В структуре вируса обнаружено пять белков, однако наиболее важным в антигенном отношении является белок, обозначаемый 32Д. Образование антител на данный белок в организме птицы защищает ее от инфицирования, создавая напряженный иммунитет. Выявлено два серотипа возбудителя инфекционного бурсита птиц, что обусловлено различным сочетанием поверхностных структурных белков VP (1,2,3,4, X), однако у цыплят наибольшее значение имеет серотип 1.
Вирус обладает высоким тропизмом к В-лимфоцитам, несущим на своей поверхности рецепторы к иммуноглобулинам класса М. В опытах in vitro доказана устойчивость Т-популяции клеток к патогенному действию вируса. В связи с тропизмом вируса к В-лимфоцитам в патологический процесс при инфекционном бурсите в большей степени вовлечена фабрициева бурса у цыплят в возрасте ее наибольшего функционирования. При этом патогистологические изменения характеризуются некрозом лимфоцитов внутри фолликулов органа с последующим инфильтрированием образующихся вакуолей воспалительным экссудатом с примесью псевдоэозинофилов. В интерфолликулярной зоне отмечается отек и кровоизлияния с разростом соединительной ткани. Также в патологический процесс вовлекаются лимфоидные клетки селезенки, кишечника и почек. Причем поражения почек вызваны главным образом деструктивным действием циркулирующих в крови иммунных комплексов.
Лабораторная диагностика. Инфекционный бурсит относится к трудно диагностируемым болезням в связи с наслаиванием вторичных инфекций и трудностями первичной изоляции вируса при эпизоотической вспышке, поэтому диагностика основана на обнаружении антител в сыворотке крови или вирусного антигена в патматериале иммунологическими и молекулярными методами. Подозрение на инфекционный бурсит должно вызывать внезапное появление болезни с массовыми водянистыми поносами и поражением фабрициевой бурсы.
Отбор патматериала для вирусологического исследования проводят при появлении первых клинических признаков болезни в хозяйстве, так как выделение вируса возможно только в начальный период эпизоотической вспышки. В дальнейшем выявление больной птицы возможно только серологическим исследованием сыворотки крови.
Для лабораторного исследования от птицы берут фабрициеву бурсу, печень, селезенку и почки, которые отправляют в лабораторию в замороженном виде в термосе со льдом. Для серологического исследования отбирают пробы сывороток крови от больной и переболевшей птицы.
Подготовка материала заключается в приготовлении 10%-ной суспензии на изотоническом растворе натрия хлорида с последующим центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость обрабатывают по 1000 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина при 4ºС в течение 6-12 часов и используют для выделения вируса на РКЭ или чувствительной птице. Сыворотку крови инактивируют при 58ºС в течение 30 минут. Из тканей фабрициевой бурсы готовят не менее трех тонких препаратов-отпечатков, высушивают, фиксируют 10-20 минут в ацетоне и исследуют в РИФ после промывания в двух сменах фосфатно-буферного раствора.
Лабораторная диагностика инфекционного бурсита проводится по двум направлениям:
- первичное обнаружение вируса в патматериале;
- выделение вируса и его идентификация;
- обнаружение специфических антител в сыворотке крови больной и переболевшей птицы.
Первичное обнаружение вируса проводят реакцией иммунофлуоресценции при исследовании препаратов-отпечатков из тканей фабрициевой бурсы. Предварительный диагноз считают установленным в случае обнаружения во всех препаратах не менее 2-3 инфицированных клеток со специфическим ярко-зеленым свечением цитоплазмы (в виде мелких гранул или диффузного ореола вокруг ядра) при отсутствии ядерного свечения.
Выделение вируса проводят путем заражения не менее десяти 10-11-дневных развивающихся куриных эмбрионов из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням. Куриные эмбрионы заражают на хорион-аллантоисную оболочку и инкубируют в течение 10 суток. Погибшие эмбрионы вскрывают в день гибели, оставшиеся – на десятые сутки. Вирус инфекционного бурсита вызывает гибель эмбрионов на 3-7-е сутки после заражения, при этом отмечают гиперемию и кровоизлияния в ранние сроки гибели эмбрионов, а после 4-5-го дня – отечность брюшной полости, некрозы и кровоизлияния в печени, селезенке и почках. Хорион-аллантоисная оболочка при этом утолщена и отмечают ее помутнение.
Для выделения также возможно использование 24-48-часовых культур фибробластов куриных эмбрионов или 21-25-дневных цыплят. Цитопатическое действие вируса на культуре клеток характеризуется образованием через 34-72 часа пустот, вакуолизацией и округлением клеток с дальнейшим образованием клеточных конгломератов.
Изолированный на РКЭ и культурах клеток вирус исследуют на отсутствие гемагглютинации с целью дифференциации от патогенных гемагглютинирующих вирусов птиц. Отсутствие гемагглютинации позволяет предположить наличие вируса инфекционного бурсита в материале.
Идентификацию вируса проводят в РН на куриных эмбрионах, которых заражают в аллантоисную полость смесями различных разведений вируса (от 10-1 до 10-9) с постоянной дозой иммунной сыворотки. Результат реакции оценивают по индексу нейтрализации, который при значении в 2 lg и более указывает на положительную идентификацию вируса болезни инфекционного бурсита. Идентификацию вируса также возможно проводить в РИД в 1%-ном агаровом геле на предметных стеклах или чашках Петри, ИФА и ПЦР.
Серодиагностика инфекционного бурсита заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови в РН, РИД и твердофазном варианте ИФА. В связи с быстрым распространением инфекции среди поголовья птиц обнаружение антител у небольшого числа их позволяет считать все поголовье инфицированным.
Инфекционный ларинготрахеит - вирусная контагиозная болезнь, поражающая главным образом кур и фазанов всех возрастов, а также индеек. Заболевание характеризуется катаральным или фибринозным воспалением слизистых оболочек, и по локализации различают ларинготрахеитную и конъюнктивальную формы. В ряде случаев в патологический процесс могут вовлекаться легкие с развитием катаральной пневмонии. Возбудителем инфекционного ларинготрахеита птиц является вирус из семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae безымянного рода. Как и все герпесвирусы, вирус инфекционного ларинготрахеита птиц формирует в чувствительных клетках внутриядерные включения, обнаружение которых из-за характерной морфологии имеет диагностическое значение.
Хотя штаммы вируса инфекционного ларинготрахеита птиц, изолируемых от кур на территории СНГ, отличаются по вирулентным и иммунологическим свойствам, антигенных различий у возбудителя не выявлено. В природе установлена циркуляция природоослабленных штаммов, некоторые из которых используют для иммунизации птиц.
Возбудитель инфекционного ларинготрахеита птиц способен длительно персистировать в организме животного, поэтому у птиц-реконвалесцентов установлено носительство длительностью до 2 лет.
Отбор патматериала. Для вирусологического исследования от больных птиц берут экссудат из трахеи, от павших или вынужденно убитых в начальный период болезни (между 2-7 днями) – слизистые оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы, носовых ходов и кусочки легких. Материал помещают в термос со льдом и направляют в лабораторию.
Для серологического исследования берут кровь на 14-й и 28-й дни после появления болезни не менее чем от 5-10 птиц (по 5 мл крови от каждой птицы). Сыворотку из крови получают общепринятыми методами. До исследования пробы сыворотки сохраняют в замороженном состоянии при минус 20-70˚С.
Для гистологического исследования направляют пробы тех же органов, помещенные в 10%-ный раствор нейтрального формалина. Необходимо помнить, что выявление специфических внутриядерных включений при инфекционном ларинготрахеите является возможным только в случае гистологического исследования материала, отобранного до наступления некроза в тканях (до 5-го дня после заражения).
Подготовка материала. Из патологического материала готовят 20%-ную суспензию (1:5) на растворе Хенкса или изотоническом растворе натрия хлорида. После этого ее центрифугируют при 1500-2000 об/мин. К надосадочной жидкости добавляют по 1000 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина в расчете на 1 мл, выдерживают в течение 3-8 часов при 2-4˚С и используют для заражения биологических тест-объектов. Материал, присланный для гистологического исследования, отмывают от формалина, делают мазки из соскобов эпителия слизистой оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы. Сыворотки, присланные для серологического исследования, инактивируют при 56˚С в течение 30 минут.
Лабораторную диагностику инфекционного ларинготрахеита проводят по следующим направлениям:
- обнаружение специфических телец-включений в патматериале гистологическим методом или вирусного антигена в соскобах из трахеи с последующим выделением вируса и ее идентификацией;
- выявление прироста антител в сыворотке крови больной или переболевшей птицы (ретроспективная серодиагностика).
Обнаружение специфических телец-включений при инфекционном ларинготрахеите имеет диагностическое значение из-за характерной морфологии. Для этого фиксированные в абсолютном метиловом спирте мазки со слизистых оболочек окрашивают краской Гимза (1 капля на 1 мл дистиллированной воды) в течение 2 часов при 37˚С, затем мазки промывают, снова обрабатывают абсолютным метиловым спиртом, высушивают и исследуют под микроскопом.
В положительных случаях обнаруживают внутриядерные включения светло-красного цвета на фоне бледно-голубой цитоплазмы клеток с более темным ядром. Специфические внутриядерные включения могут быть шарообразные, продолговатые, иногда в форме диплококков; занимают половину или треть ядра, окружены ясно видимым светлым ободком (характерный признак). Количество их в ядре может быть от одного до четырех. Болезнь можно диагностировать на основании обнаружения внутриядерных включений Зейфрида.
Первичное обнаружение вируса в патматериале можно проводить при помощи РИФ прямым методом с исследованием мазков со слизистых оболочек трахеи и конъюнктивы. Обычно положительный результат иммунофлуоресценции совпадает с обнаружением внутриядерных включений. С этой целью могут быть использованы ИФА и РИД
Выделение вируса осуществляют на РКЭ, реже – культурах клеток. Приготовленной 20%-ной суспензией заражают 10 эмбрионов 9-12- дневного возраста на ХАО. Гибель в первые 24 часа считают неспецифической. Оставшихся живых эмбрионов убивают на 6-8-й день и вскрывают. Штаммы вируса инфекционного ларинготрахеита вызывают локальные поражения хорион-аллантоисной оболочки в виде очаговых поражений на месте инокуляции вируса и появления по всей поверхности оболочки узелковых поражений. Считается, что крупноузелковые поражения с некротическим центром вызываются высоковирулентными штаммами вируса. Появление на ХАО мелких узелков без некроза обычно наблюдают при заражении эмбрионов вирусами, выделяемыми в конце эпизоотической вспышки болезни.
В случае отсутствия вышеотмеченных изменений на ХАО проводят второй пассаж путем заражения второй партии эмбрионов суспендированной в аллантоисной жидкости хорион-аллантоисной оболочки предыдущего пассажа. Для выявления специфических обнаружений рекомендуется проведение не менее трех пассажей.
При выделении вируса инфекционного ларинготрахеита на культурах клеток эмбрионов или цыплят через 24-72 часа обнаруживают появление многоядерных гигантских клеток, в которых обнаруживают внутриядерные включения.
Идентификацию вируса проводят в РИД, РИФ или РН. При постановке РИД используют 1,5%-ный агаровый гель, приготовленный на вероналовом буфере. Обычно для идентификации вируса используют набор куриных антисывороток, полученных к различным вирусам птиц, что позволяет дифференцировать изолированные вирусы.
Результаты РН на развивающихся куриных эмбрионах оценивают по индексу нейтрализации: от 1 до 9 считают отрицательным, от 10 до 49 – сомнительным, свыше 50 – положительным.
Серодиагностика и ретроспективная диагностика заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови больной птицы. В серологических реакциях определяют титры антител и устанавливают их прирост при исследования парных проб сывороток крови, что свидетельствует о наличии и распространенности инфекции в хозяйстве, а сохранение или снижение уровня антител – о прошедшей инфекции. Для серологической диагностики применяют РН, РИД, РИФ или ИФА.
Болезнь Марека - высококонтагиозная болезнь кур и индеек, проявляющаяся в двух формах – классической в виде поражения нервной системы и острой в виде лимфоидного лейкоза.
Наличие двух форм клинического проявления обусловлено в первую очередь вирулентностью вируса, а также чувствительностью птицы. При классической форме болезнь Марека характеризуется хромотой, парезами, параличами крыльев, шеи и хвоста. У больной птицы также изменяется цвет радужной оболочки за счет инфильтрации тканей глаза опухолевыми клетками (обычно лимфоидными и псевдоэозинофильными клетками). Поражения нервной системы обусловлены лимфоидно-клеточной инфильтрацией нервных волокон.
Острое течение характеризуется преимущественно опухолевой инфильтрацией внутренних органов и в значительно меньшей степени – центральной и периферической нервной системы. Остро болезнь протекает чаще у птиц до половозрелого возраста с наибольшим процентом гибели больных животных. При этом формирующиеся опухоли по природе также являются лимфоидными.
Возбудителем болезни Марека является вирус безымянного рода, подсемейства Alphaherpesvirinae, семейства Herpesviridae. Это ДНК-геномный вирус, имеющий в составе вириона линейную двунитчатую молекулу ДНК. Кроме возбудителя болезни Марека, в данный род также включен возбудитель злокачественной катаральной горячки.
Вирус болезни Марека обладает выраженными онкогенными свойствами, поэтому вызываемое им заболевание является опухолевым по природе. В этой связи патогенность возбудителя определяется главным образом способностью вируса вызывать трансформацию клеток-мишеней в опухолевые (это свойство иначе называют онкогенностью). Также установлено, что не все штаммы вирусов болезни Марека обладают выраженными онкогенными свойствами, поэтому их принято разделять на высокоонкогенные, неонкогенные и отдельно группу вирусов, вызывающих схожее заболевание у индюков (герпесвирусы индюков). Неонкогенные штаммы вируса не обладают патогенностью и поэтому являются авирулентными.
Установлено, что все онкогенные штаммы вируса болезни Марека содержат в составе генома участки, кодирующие специфические антигенные детерминанты, в частности гликопротеид gp5. Поэтому различия в составе этого гликопротеида позволяют на молекулярном уровне разграничивать высоко - и низкоонкогенные штаммы вируса, а также установить принципиальное отличие классического вируса болезни Марека от герпеса индеек.
Вирус болезни Марека в организме зараженной птицы существует в двух формах: тесно связанного с клеткой (интегрированный вирус) и свободного от интеграции с клеточным геномом. Первую форму иначе называют клеточно-связанным вирусом, она обусловливает в основном персистентную форму инфекции, при которой вирусный геном интегрируется с геномом лимфоцитов тимуса, селезенки или бурсы. Установлено, что в геном одной клетки интегрируется от 3 до 12 полных геномов вируса болезни Марека – в таком состоянии он может персистировать пожизненно. Выделение из материала клеточно-связанного вируса обычно представляет большую сложность.
Второй формой существования, характерной высокоонкогенным штаммам вируса, является клеточно-свободная форма. Вирусы этой формы представляют собой активно реплицирующийся геном. Чаще всего вирус размножается в клетках лимфоидных органов (фабрициева сумка, селезенка, тимус, миндалины, слепая кишка), эпителиальных клетках почечных фолликулов. В последних вирус обнаруживается у птиц всех возрастов независимо от метода заражения и форм проявления заболевания. В этой связи исследование перьевых фолликулов кожи достоверно дает возможность судить о зараженности птицы онкогенными штаммами вируса. Авирулентные слабоонкогенные штаммы вируса, а также вирусы герпеса индеек в эпителии перьевых фолликулов никогда не размножаются.
Обычно выделить вирус болезни Марека в клеточно-свободной форме значительно легче, чем в состоянии интеграции с геномом клеток.
В составе вируса выявлено 6 антигенов, из которых антигены А, В и С имеют наибольшее значение. Антиген А входит в состав вириона в отличие от В и С, которые связаны с зараженной клеткой. Вышеуказанный антиген А является общим для всех штаммов вируса, поэтому различий в антигенной характеристике вируса болезни Марека нет.
Отбор патматериала. В лабораторию направляют 5-10 клинически больных цыплят, от которых берут кровь и в обязательном порядке перья. С этой целью от каждой птицы с наружной поверхности бедра выщипывают по 10-15 перьев с наличием производящей ткани (эпителий перьевых фолликулов) внутри очина. После вскрытия отбирают кусочки пораженных внутренних органов, кожи, мышц и периферических нервов. Патологический материал должен быть происследован не позднее 2-3 часов после взятия.
Часть крови отстаивают для получения сыворотки, а остальную стабилизируют добавлением 15-20 ЕД/мл гепарина или 5%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 1:9. Кроме патматериала, отобранного по вышеописанной методике, в лабораторию направляют для гистологического исследования пробы материала размером 1х2х2 см, фиксированные в 10%-ном нейтральном растворе формалина.
Подготовка материала. Успешное выделение вируса болезни Марека зависит от правильности подготовки патматериала. Из проб внутренних органов готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса с добавлением антибиотиков. Затем к приготовленной суспензии добавляют равный объем стабилизированной крови. Приготовленный таким образом материал можно использовать для заражения РКЭ в желточный мешок.
При подготовке материала из перьевых фолликулов важным является получение суспензии, содержащей клеточно-свободный вирус. Для этого пробы пера (10-15 очинов) выдерживают 30 минут в дистиллированной воде с антибиотиками (по 1000 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, 50 ЕД/мл нистатина), затем содержимое очинов пинцетом выдавливают в ступку и тщательно растирают, добавляя 10 мл физиологического раствора. Приготовленную суспензию центрифугируют 20 минут при 20 минут при 3000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость используют для заражения РКЭ на хорион-аллантоисную оболочку.
Подготовка проб почек для исследования включает тщательное отмывание проб раствором Хенкса, после чего их заливают 0,25%-ным раствором трипсина в соотношении 1:10 для проведения трипсинизации в течение 20-30 минут при 22-25ºС. Клеточную взвесь фильтруют через марлю, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, а осадок ресуспендируют в питательной среде до концентрации 3-4 млн клеток в 1 мл. Добавляют антибиотики по 1000 ЕД/мл, выдерживают 60 минут при 4ºС и используют для заражения культур клеток.
Из проб материала, доставленного для гистологического исследования, готовят замороженные или парафиновые срезы, которые после обработки окрашивают гематоксилин-эозином.
Лабораторная диагностика болезни Марека включает:
- первичное обнаружение возбудителя в патматериале методом иммунофлуоресценции и реакцией иммунодиффузии, обнаружение характерных патогистологических изменений с последующим выделением вируса на чувствительных тест-объектах и его идентификацией;
- выявление антител к вирусу у птиц РИД в геле и ИФА.
Обнаружение возбудителя в патматериале проводят несколькими способами. Экспресс-диагностика болезни Марека заключается в обнаружении вирусного антигена в препаратах из перьевых фолликулов методом иммунофлуоресценции. При этом РИФ применяют в прямом и непрямом вариантах с использованием приема контрастирования фона бычьим альбумином, меченым родамином. В положительных случаях специфическое свечение в виде светящегося ободка регистрируют в цитоплазме клеток в перинуклеарной зоне.
Кроме того, обнаружение вирусного антигена возможно реакцией иммунодиффузии, в которой исследуют суспензию из эпителия перьевых фолликулов. Последнюю готовят следующим образом: 10-15 очинов перьев измельчают ножницами на кусочки размером 1-2 мм, затем растирают в ступке, заливают физиологическим раствором 1:10, три раза замораживают и оттаивают, после чего выдерживают сутки при 4ºС. Образовавшуюся надосадочную жидкость используют в качестве антигена.
Гистологический метод в диагностике болезни Марека играет важную роль. При этом патогистологические изменения в нервах характеризуются инфильтрацией лимфоидными клетками. Изменения в коже характеризуются образованием лимфоидных фокусов вблизи перьевых фолликулов. Патологические изменения фабрициевой бурсы характеризуются либо дегенерацией, либо пролиферацией лимфоидных органов, а также атрофией, образованием кист, очаговым некрозом.
Выделение вируса проводят путем заражения исходным материалом РКЭ, при этом биопробу ставят одновременно в двух вариантах. Первый вариант заключается в заражении 10-15 эмбрионов (10-12- дневных) на ХАО, используя для этого клеточно-свободный фильтрат (приготовление суспензии из материала для заражения ХАО см. выше). При наличии в исследуемом материале вируса болезни Марека на 7-8-й день культивирования по всей поверхности оболочки появляются очаги клеточной пролиферации в виде пустул и бляшек диаметром 1-3 мм, у эмбриона отмечают спленомегалию и поражение печени. Гибель эмбрионов считают специфической через 72 часа после заражения.
Второй вариант заключается в заражении 10-15 развивающихся куриных эмбрионов 4-5- дневного возраста в желточный мешок. При этом материалом для заражения служат смесь равных частей стабилизированной крови и 10%-ной суспензии внутренних органов. Инкубацию эмбрионов осуществляют в течение 13-14 дней, при этом гибель их считается специфической только с 8-9-го дня инкубации.
Инфицированные эмбрионы исследуют на 12-й день после заражения. При этом обращают внимание на очаговое поражение хорион-аллантоисной оболочки с их подсчетом: (-) – поражения отсутствуют, (+) – от 1 до 20 очагов; (++) – от 21 до 100 очагов; (+++) – более 100 очагов на поверхности хорион-аллантоисной оболочки. Положительным считают результат исследования, при котором выявлено очаговое поражение ХАО на ++ и более примерно у 30% зараженных эмбрионов.
Одновременное использование обоих методов заражения РКЭ дает возможность выделить как клеточно-свободный вирус из перьевых фолликулов (на ХАО), так и клеточно-связанный вирус из внутренних органов больной птицы (путем заражения в желточный мешок).
При отсутствии РКЭ возможно проводить выделение вируса на культурах клеток. С этой целью используют первичные культуры клеток почек куриных эмбрионов или цыплят, культуры фибробластов куриных или утиных эмбрионов. Культивирование клеток лучше проводить в небольших матрасах или чашках Петри. Для последующей идентификации в РИФ в посуду с культурами клеток помещают покровные стекла. Материалом для заражения служит суспензия, приготовленная из пораженных органов (чаще почек) по вышеописанной методике (см. в разделе «Подготовка материала»).
Способ заражения клеточных культур зависит от исследуемого материала: при выделении вируса из клеток (клеточно-связанный вирус) взвесь их добавляют в культуру и оставляют на 12-24 часа, после чего питательную среду меняют. Бесклеточные материалы (клеточно-свободный вирус) вводят непосредственно на отмытый слой клеток в течение 30 минут при 37ºС, а затем добавляют поддерживающую среду.
При первичном выделении вируса болезни Марека ЦПД в первом пассаже не проявляется, поэтому на 7-8-й день проводят второй пассаж, заражая новый монослой суспензии клеток, полученной путем добавления 0,125%-ного раствора трипсина в монослой первого пассажа (концентрация суспензии должна составлять 3-4 млн клеток на один монослой). Таким образом, проводят культивирование вирусов не менее чем в трех пассажах. ЦПД, вызываемое вирусом болезни Марека, характеризуется образованием фокусов из округленных рефрактильных клеток, синцитиев и микроскопически видимых бляшек. В зараженных клетках появляются внутриядерные включения.
Идентификацию выделенного вируса осуществляют (1) в РИД с исследованием суспензии (1:3) хорион-аллантоисной оболочки в смеси с экстраэмбриональной жидкостью или РРИД (реакция радиальной иммунодиффузии), а также (2) в РИФ с исследованием зараженного вирусом клеточного монослоя на покровных стеклах.
Серодиагностика и ретроспективная диагностика основана на выявлении специфических антител в сыворотке крови с помощью РИД или ИФА. При этом необходимо иметь в виду, что антител образуются в организме на попадание любого штамма вируса с различной онкогенностью, поэтому значение серодиагностики невелико.
Инфекционный бронхит кур -высококонтагиозная болезнь кур, проявляющаяся у цыплят респираторной или нефрозо-нефритной формами, а у кур – поражением органов размножения.
Первые две формы наблюдают у цыплят до 2-3- месячного возраста и характеризуются высокой летальностью. Поражение репродуктивных органов регистрируется обычно у кур старше 6 мес., и заболевание протекает бессимптомно или с незначительным поражением органов дыхания, характеризуется длительным снижением яйценоскости.
Возбудителем инфекционного бронхита кур является вирус из семейства Coronaviridae, рода Coronavirus. Это РНК-геномный вирус, содержащий односпиральную молекулу плюс-нити РНК. Вирус является сложноорганизованным с наличием суперкапсида. В составе вируса инфекционного бронхита кур обнаружено два основных гликопротеина, один из которых расположен на поверхности вириона (S- белок), а второй – на поверхности капсида (М- белок). При этом поверхностный гликопротеин имеет пять центров, взаимодействующих с антителами (пять эпитопов), обозначаемых как А-Е. Первые четыре не подвержены изменчивости и остаются постоянными в пределах вирусной популяции одного серотипа. Совокупность поверхностных эпитопов определяет антигенную структуру вируса инфекционного бронхита кур. До настоящего времени выделено не менее 7 основных серотипов вируса: A, B, C, D, Массачусетс, ИК11, ИК12, а также некоторые другие подтипы внутри указанных типов. Выделяемые от кур на территории СНГ штаммы вирусов инфекционного бронхита кур в большинстве случаев относят к серотипу Массачусетс. Однако в практических условиях серологическое типирование является затрудненным в связи с различной антигенной активностью штаммов вируса в разных серологических реакциях.
Вирус обладает тропизмом к эпителиальным клеткам трахеи, отдельные штаммы имеют нефрогенную тропность. Кроме того, вирус инфекционного бронхита кур способен локализоваться в лейкоцитах и эритроцитах, что наблюдают в начальный период развития болезни. Вирус способен длительно персистировать в клетках почек и легких у переболевшей птицы, что обусловливает высокий процент носительства вируса у птицы.
Вирусные частицы имеют на своей поверхности молекулы гемагглютинина, однако они скрыты молекулами фосфолипидов и суперкапсидных белков. В этой связи появление гемагглютинирующей активности у вируса возможно только после обработки вириона фосфолипазой и трипсином.
Обычно выделение вируса и серологическая диагностика болезни представляет значительные трудности в связи с широким применением живых и инактивированных вакцин.
Отбор патматериала. Для исследования от больной птицы берут смывы с трахеи и гортани во время инкубационного периода или проявления ярких клинических признаков. От вынужденно убитых животных берут кусочки легких, почек, соскобы с трахеи, гортани и бронхов; от взрослой птицы – почки и яйцеводы. В период острого течения болезни вирус может быть выделен из яиц. Испытуемый материал до исследования можно хранить при температуре минус 20-70ºС в течение 1 недели.
Подготовка материала заключается в приготовлении 10%-ной суспензии на растворе Хенкса или изотоническом буферном растворе. После этого ее центрифугируют в течение 15 минут при 2-3 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (2000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина) в течение 1,5-2 часов в холодильнике (4ºС), после чего используют для заражения чувствительной системы. Из осадка, полученного после центрифугирования смывов со слизистой оболочки верхних дыхательных путей, готовят мазки на предметных стеклах, подсушивают на воздухе, фиксируют ацетоном при комнатной температуре и исследуют методом иммунофлуоресценции.
Лабораторную диагностику инфекционного бронхита кур можно проводить по двум направлениям:
- обнаружение вирусного антигена в патматериале с последующим выделением вируса на РКЭ и его идентификацией серологическими реакциями;
- выявление специфических антител в крови больных и переболевших животных или в желтках яиц от больной птицы.
Обнаружение вируса в патматериале проводят в ходе постановки РИФ с исследованием мазков из смывов со слизистых оболочек верхних дыхательных путей.
Выделение вируса осуществляют путем заражения РКЭ 8-10-дневного возраста в аллантоисную полость. Для этого используют 5-10 куриных эмбрионов, которые инкубируют при 37ºС. Спустя 1-3 дня после заражения треть эмбрионов убивают путем охлаждения при 4ºС и отбирают аллантоисную жидкость и хорион-аллантоисную оболочку для следующего пассажа. Остальную часть эмбрионов вскрывают на 7-8-й день и исследуют на наличие макроскопических изменений. Обычно вирус инфекционного бронхита кур требует определенное время для адаптации, поэтому иногда при выделении полевых изолятов вируса приходится делать не менее 6-8 слепых пассажей до появления характерных для вируса инфекционного бронхита кур патологических изменений: карликовость эмбрионов с массой 8-14 г вместо 35 г, перекручивание шеи и прилипание лапок к голове. Свернувшиеся в клубок инфицированные зародыши округлой формы, уплотненной консистенции, оболочка амниотической полости утолщена и имеет фибринозные налеты. Эффект карликовости эмбрионов является патогномоничным признаком для вируса инфекционного бронхита кур.
Для подтверждения наличия вируса в экстраэмбриональной жидкости ставят РГА, предварительно обработав материал трипсином.
Параллельно с выделением вируса на РКЭ целесообразно ставить биопробу на 10-25-дневных цыплятах, которых заражают интратрахеально по 0,-0,3 мл вируссодержащей суспензии. Использование культур клеток имеет особенности, так как вирус инфекционного бронхита кур приобретает способность размножения в культурах клетках только после длительной (6-10 пассажей) адаптации. Лучшей из них является культура трахеи 20-дн эмбрионов, в которых вирус вызывает стаз ресничек эпителия.
Идентификацию изолированного вируса осуществляют в серологических реакциях, наиболее важными из которых являются РИД, РН, РИФ и РТГА. Реакция иммунодиффузии идентифицирует вирус инфекционного бронхита кур без определения его типовой принадлежности, так как используемая в реакции специфическая сыворотка реагирует с вирусом болезни независимо от его серологической идентичности. Испытуемым антигеном в реакции являются суспензии из хорион-аллантоисных оболочек зараженных куриных эмбрионов (через 48 часов после заражения). В качестве антитела используют специфическую сыворотку к вирусу инфекционного бронхита кур (желательно использование набора диагностических гипериммунных сывороток против инфекционного бронхита кур, инфекционного ларинготрахеита, ньюкаслской болезни, оспы птиц, что дает возможность дифференцировать эти заболевания птиц).
Для более подробной идентификации вируса инфекционного бронхита кур с целью определения серотипа изолированного штамма проводят постановку РН на куриных эмбрионах. С этой целью используют специфические сыворотки к трем серотипам вируса инфекционного бронхита кур: Массачусетс, Коннектикут, Айова-97. В реакции используют десятикратные разведения идентифицируемого вируса (от 10-1 до 10-6), к которым добавляют равный объем (по 0,5 мл) специфической сыворотки трех типов. После экспозиции 1-2 часа при 4ºС смесь инокулируют в аллантоисную полость куриным эмбрионам по 0,2 мл, при этом смесью с каждым типом сыворотки заражают по 4 эмбриона. Наблюдение за тест-объектами проводят в течение 8 суток. Реакция нейтрализации считается положительной при отсутствии гибели эмбрионов и патологоанатомических изменений в них при вскрытии. Результат оценивают по индексу нейтрализации: при индексе 1 lg реакцию считают отрицательной, от 1 до 2lg – сомнительной, выше 2lg - положительной. Отрицательный результат РН может свидетельствовать о присутствии в изоляте гетерологического типа вируса инфекционного бронхита кур, не относящегося ни к одному из трех вышеуказанных серотипов.
Серодиагностика и ретроспективная диагностика основана на выявлении антител в крови птицы или желтках яиц от больной птицы. Однако серологические данные не позволяют судить о резистентности популяции птиц, так как не всегда уровень антител коррелирует с его уровнем и установить с высокой надежностью серотип вируса в связи с большим числом перекрестных серологических в сыворотках крови цыплят более старшего возраста.
Для исследования берут по 5 мл крови не менее чем от 5-10 больных птиц на 14-й и 28-й дни болезни. Уровень антител определяют в РН, РИД, РТГА и ИФА. Перед постановкой реакции нейтрализации все исследуемые сыворотки прогревают при 58ºС в течение 30 минут, добавляют пенициллин и стрептомицин по 100-1000 ЕД/мл. В реакции нейтрализации в качестве антигена используют штаммы Боддетт и Массачусетс, которые способны вызывать гибель эмбрионов через 24-48 часов.
