Лекция 5. Вирусы респираторно-репродуктивного синдрома свиней, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, энзоотического энцефаломиелита свиней (болезни Тешена)

Респираторно-репродуктивный синдром свиней - вирусная болезнь свиней, характеризующаяся массовыми абортами у свиноматок на последней стадии супоросности, преждевременными родами, рождением нежизнеспособного приплода и поражением респираторного тракта.

Возбудителем респираторно-репродуктивного синдрома свиней (РРСС) является вирус из семейства Arteriviridae, рода Arterivirus. Это РНК-геномный вирус, содержащий в составе генома плюс-нить РНК. В вирионе РРСС обнаружены 3 структурных белка: нуклеокапсидный (N), капсидный белок М и суперкапсидный белок Е. Вирус впервые был изолирован в 1991 году в Нидерландах при изучении нового заболевания свиней, появившегося в 1987 году в свиноводческих хозяйствах США и Канады. По месту выделения вирус получил также второе название – вирус Лелистад. Биологические характеристики возбудителя остаются малоизученными. Изоляты вируса РРСС различают между собой по патогенности для свиней, действию на клетки и ткани, степени и возможности их репродукции в разных тест-системах, по выраженности бляшкообразования, антигенности, что обусловливает различное проявление болезни у свиней. В настоящее время выделяют две генетические группы вируса РРСС: американскую и европейскую, отличающихся в серологических перекрестных реакциях. Предполагают, что вирус обладает тропизмом к клеткам эндотелия кровеносных сосудов, а также клеткам дыхательной системы. Установлено, что вирус in vitro обладает способностью длительно персистировать в макрофагах, что вероятно обусловливает наблюдаемое в патогенезе болезни состояние иммунодефицита.

Учитывая панзоотический характер распространения инфекции, подозрение на РРСС должно вызывать любое заболевание, сопровождающееся массовыми абортами у свиней. В ряде стран в качестве диагностического критерия приняты три теста: мертворождение не менее 20% свиноматок, аборты и преждевременные роды у 8% и смертность поросят в первую неделю не менее 25%. Совпадение двух из трех критериев позволяет подозревать РРСС.

Для исследования в лабораторию направляют абортированные плоды, от павших – кусочки внутренних органов. Выделение вируса также возможно из плазмы крови. Для серологического исследования направляют пробы сывороток крови свиноматок, взятые через 1-2 мес. после аборта или опороса, поросят до приема ими молозива или от клинически больных поросят. Из доставленного материала в лаборатории приготавливают суспензии по общепринятой методике, которую в дальнейшем используют для выделения вируса на культурах клеток. Наилучшим тест-объектом для выделения вируса является первичная культура клеток альвеолярных макрофагов 2-6-недельных поросят (АМФ) и перевиваемая линия MARC-145. Учет ЦПД проводят через 24, 48, 72, 96 и 120 часов, при этом отмечают округление клеток с последующим пикнозом и отделением от монослоя в течение 2-4 суток. Получаемую культуральную жидкость используют затем в качестве антигена для исследования в варианте ELISA. Также выявление больных и инфицированных животных в хозяйстве возможно при исследовании сывороток крови свиноматок. Выявление антител в сыворотке крови устанавливают путем постановки ИФА, НРИФ, РН.

Трансмиссивный гастроэнтерит свиней - остро протекающая высококонтагиозная болезнь, главным образом, поросят до 3-недельного возраста, проявляющаяся диареей и рвотой. Наиболее тяжело болезнь протекает у молодняка и характеризуется сильным поносом, выделением жидких фекалий и гибелью от 100% (у поросят 1-5-дневного возраста) до 70% (у поросят 6-10- дневного возраста). Взрослые животные клинически болеют очень редко, однако длительное время являются вирусоносителями и выделяют вирус с фекалиями во внешнюю среду.

Возбудителем трансмиссивного гастроэнтерита свиней является вирус из семейства Coronaviridae, рода Coronavirus. Кроме возбудителя трансмиссивного гастроэнтерита свиней данный род включает возбудителей инфекционного бронхита кур, коронавирус диареи новорожденных телят, коронавирус собак, вирус синюшной болезни индюков и некоторые другие. Все они объединены общностью их строения, которое включает наличие плюс-нити РНК, покрытой капсидом и суперкапсидом. Вирионы вируса содержат несколько белков: наружный суперкапсидный белок Е2 и его предшественник, низкомолекулярный капсидный белок Е1, нуклеопротеид N. На поверхности вириона имеются характерные, редко расположенные булавовидные выступы, образующие подобие солнечной короны. Гликопротеиды булавовидных выступов придают вирусу гемагглютинирующую активность в отношении эритроцитов цыплят, морских свинок и крупного рогатого скота. Штаммы вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, выделенные от свиней, серологически идентичны. Однако существует иммунологическое различие между кишечным и культуральным вирусом трансмиссивного гастроэнтерита, которое особенно сильно проявляется после 160 пассажей на культурах клеток. Последний при длительном культивировании in vitro может терять свою иммуногенную активность. Коронавирус собак, вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней и вирус инфекционного перитонита кошек в антигенном отношении очень близки, что дало возможность выделить их в единую антигенную родственную группу агентов внутри семейства Coronaviridae.

Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней обладает тропизмом к эпителиальным клеткам тонкого кишечника, где он реплицируется в цитоплазме цилиндрических клеток ворсинок, вызывая их патологию и деструкцию. Кроме того, вирус обнаруживается при клинической форме болезни в паренхиматозных органах и слизистой оболочке верхних дыхательных путей. У взрослых животных вирус очень редко вызывает патологию кишечных клеток, что обусловлено защитным действием секреторных IgA, однако очень длительно сохраняется, распространяется и даже репродуцируется в макрофагах внутренних органов.

Лабораторная диагностика. Для исследования в лабораторию направляют тонкий кишечник (прежде всего тощую и подвздошную кишку) и мезентеральные лимфоузлы от поросят в начальной стадии проявления клинических признаков болезни. Кроме того, отправляют кусочки паренхиматозных органов. Патологический материал от трупов, пролежавших более 2 часов после гибели, для исследования непригоден. Материал необходимо брать от 9-10 поросят из 3-5 пораженных пометов (по 2-3 поросенка из помета) в количестве 10 г от животного. Отрезок кишки длиной 10-12 см перевозят и берут с содержимым. Пробы материала доставляют в лабораторию в плотно закрытых стеклянных флаконах, помещенных в термос с сухим льдом.

Для серологического исследования направляют парные пробы сывороток крови от свиноматок, в пометах которых обнаружены больные новорожденные поросята, взятые в интервале 21 день.

Подготовка материала. В лаборатории из доставленного материала (отдельно кишечника и паренхиматозных органов) готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса по общепринятой методике и после проверки на бактериальную обсемененность используют для заражения чувствительной биологической системы. Одновременно с приготовлением суспензии готовят препараты-отпечатки из внутренних органов, реже гистосрезы для исследования в РИФ.

Индикацию вируса в патматериале проводят путем исследования проб в РИФ, которую используют в прямом и непрямом вариантах. Наличие ярко-зеленого свечения клеток или их цитоплазмы в виде ярко светящихся гранул различного размера свидетельствует о присутствии вируса. При учете реакции обращают внимание только на специфическое свечение неповрежденных клеток - свечение лейкоцитов и дегенеративно измененных клеток не учитывают.

Выделение вируса производят на первичных и перевиваемых линиях клеток поросят (почек, щитовидной и слюнных желез, тестикул), заражая приготовленной суспензией по 4-8 пробирок с монослоем для каждой пробы. Культуры ежедневно просматривают в течение 5-7 дней для регистрации ЦПД. Особенностью вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней является необходимость предварительной адаптации вируса к культуре клеток, поэтому ЦПД в первых пассажах обычно не наблюдают. В этой связи при отсутствии ЦПД в первом пассаже проводят 5-7 последовательных пассажей до наступления характерных цитопатических изменений.

ЦПД вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней характеризуется: 1) набуханием, утолщением с последующим укорочением клеток до полного разрушения монослоя, а также 2) образованием синцитиев, содержащих от 2-5 до 40 ядер в одной клетке. Тельца-включения при заражении культуры клеток вирусом трансмиссивного гастроэнтерита не регистрируют. Одновременно с выделением вируса на культурах клеток целесообразно проводить выделение вируса путем заражения 2-3-дневных поросят, что обусловлено большим процентом штаммов вируса трансмиссивного гастроэнтерита, не обладающих выраженным ЦПД на культурах клеток. Экспериментальным двум-трем животным per os вводят 3-5 мл исследуемого материала или (реже) закапывают в носовые ходы. За поросятами наблюдают 72-96 часов с постоянной термометрией. Появление рвоты и диареи в течение 24-72 часов после заражения свидетельствует о присутствии вируса трансмиссивного гастроэнтерита в материале. На 3-5-й день после заражения животные погибают, после чего их вскрывают, отмечают патологоанатомические изменения и отбирают патматериал для вирусологического исследования. Предпочтительным является убой животных с диагностической целью через 24 часа после появления диареи.

Идентификацию изолированного в культуре клеток вируса осуществляют при помощи РИФ, а также РН. Реакцию нейтрализации проводят на культурах клеток, используя постоянные дозы изолируемого вируса и сыворотки. Для этого к 0,5 мл исследуемого вируса с содержанием 1000 ТЦД₅₀ в 0,1 мл добавляют 0,5 мл иммунной сыворотки, содержащей 20 нейтральных доз в 0,1 мл. После инкубирования смеси при 37ºС в течение 60 минут проводят заражение приготовленной смесью в объеме 0,2 мл четырех пробирок с культурой клеток. Учет проводят на 4-е и 7-е сутки. РН считается положительной, если специфическая сыворотка нейтрализует цитопатическое действие вируса в 50% пробирок, зараженных смесью вирус-сыворотка.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика проводится с целью постановки диагноза на прошедшую инфекцию или эпизоотологического исследования поголовья свиноматок и поросят.

Главной реакцией для выявления антител в сыворотке крови является РНГА с использованием промышленно выпускаемого эритроцитарного диагностикума. Для выяснения благополучия в хозяйствах-репродукторах два раза в год исследуют 5% поголовья свиней. Положительной считается сыворотка, которая в разведениях 1:16 и выше вызывает агглютинацию эритроцитарного диагностикума.

Кроме РНГА возможно использование РН с целью выявления титра антител в парных пробах сыворотки крови. В реакции используют постоянную дозу вируса (100-1000 ТЦД₅₀) и двукратные разведения испытуемой сыворотки, которую предварительно инактивируют в течение 30 минут при 56ºС. При массовых исследованиях целесообразно использовать РН в варианте микрометода на микропланшетах.

Также для выявления антител рекомендовано использование РТГА, ИФА (твердофазный метод).

Энзоотический энцефаломиелит свиней (болезнь Тешена) -вирусная болезнь свиней, характеризующаяся развитием негнойного энцефаломиелита и параличами. Болезнь проявляется симптомами поражения центральной нервной системы в виде гиперстазии, тонико-клонических судорог, параличей конечностей, мышц шеи и глотки. Заражение происходит алиментарно, после чего вирус размножается в клетках желудочно-кишечного тракта, в которых он обнаруживается через 24-72 часа после заражения. Затем в патогенезе болезни отмечают короткую виремию, в период которой вирус гематогенно и нейрогенно проникает в центральную нервную систему. Возбудитель обнаруживается в ЦНС только в течение первых дней паралитической стадии болезни, причем в более высоких концентрациях в шейном и грудном отделах спинного мозга и мозжечка. К 5-му дню после появления симптомов болезни содержание вируса в клетках ЦНС резко снижается, и к моменту гибели вирус в организме обнаружить невозможно (феномен аутостерилизации).

Возбудителем болезни Тешена является вирус из семейства Picornaviridae, рода Enterovirus. Вышеуказанный род является наиболее многочисленным внутри семейства и включает полиовирусы человека и мышей, возбудителей везикулярной болезни свиней, энцефаломиелита птиц и др. Для вирусов данного рода характерно широкое носительство среди клинически здоровых хозяев, а также узкий спектр патогенности. Вирус болезни Тешена на основании серологических тестов, характера ЦПД и культуральным свойствам делят на 13 серотипов, разделенных на 3 серогруппы, причем основным возбудителем болезни считается энтеровирус свиней серотипа 1 (ЭВС-1). Кроме него в природе встречаются другие энтеровирусы, вызывающие у молодняка поросят энцефаломиелитный синдром.

Возбудителем болезни Тешена является РНК-геномный вирус, имеющий в составе вириона единую молекулу плюс-нити РНК. Выявлено четыре главных структурных полипептида, которые, объединяясь друг с другом, формируют капсомер. В составе капсида имеется 60 капсомеров единой формы и величины.

Лабораторная диагностика болезни Тешена включает в себя как вирусологические, так и гистологические методы, однако решающее значение имеет вирусологическое исследование.

Отбор патматериала. Чаще отбирают кусочки из различных отделов спинного и головного мозга, прежде всего коры больших полушарий, мозжечка, продолговатого мозга, отдельные сегменты шейной и поясничной части спинного мозга. Возможно выделение вируса также из фекалий животных. Обычно берут смывы из прямой кишки, однако из кишечника многих свиней часто изолируют сиротские энтеровирусы, схожие по свойствам с возбудителем болезни Тешена, но, как правило, имеющие малое диагностическое значение. При взятии материала следует учитывать, что вирус в максимальной концентрации содержится в тканях центральной нервной системы в конце инкубационного периода или в самом начале (на протяжении 1-2 дней) паралитической стадии. В этой связи патматериал отбирают только от животных, убитых с диагностической целью в начале болезни (не позднее 3-5-го дня). После взятия пробы помещают в раствор Хенкса с антибиотиками или в стерильный забуференный 50%-ный глицерин.

Параллельно с отбором патматериала для вирусологического исследования в лабораторию отдельно направляют кусочки головного и спинного мозга для гистологического исследования. Они сразу должны быть помещены в 10%-ный забуференный формалин.

Для серологического исследования посылают сыворотку крови, взятую в ранний период заболевания и вторично спустя 1-3 недели.

Подготовка материала. Сразу после доставки в лабораторию из проб мозжечка, продолговатого и спинного мозга готовят препараты-отпечатки по общепринятой методике.

После этого кусочки тканей из различных отделов головного и спинного мозга от одного животного объединяют в одну пробу и готовят 10%-ную суспензию на фосфатно-буферном растворе. При доставке консервированного глицерином материала его отмывают фосфатно-буферным раствором. Затем приготовленную суспензию дважды замораживают и оттаивают, после чего центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают хлороформом 1:1 и отставляют на 14-16 часов в холодильнике, после чего повторно центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (1000 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина на 2 мл), выдерживают 1 час при комнатной температуре для контакта и используют для выделения вируса.

Материал, доставленный для гистологического исследования, фиксируют в 10%-ном формалине, заключают в парафин и готовят срезы, которые затем окрашивают гематоксилин-эозином.

Лабораторную диагностику болезни Тешена проводят по следующим направлениям:

- обнаружение вирусного антигена в материале методом иммунофлуоресценции с последующим выделением и идентификацией вируса;

- выявление специфических антител в крови животных;

- постановка биопробы на поросятах при получении сомнительных результатов лабораторного исследования.

Обнаружение вируса. Проведение лабораторной диагностики болезни Тешена начинают с исследования препаратов-отпечатков из органов центральной нервной системы в РИФ и гистологического исследования препаратов из головного и спинного мозга. Положительным результатом серологического исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на фоне мозговой ткани.

Гистологические изменения при болезни Тешена характеризуются картиной негнойного полиэнцефаломиелита: в различных участках спинного и головного мозга обнаруживают интенсивную деструкцию нейронов с преимущественной локализацией в сером мозговом веществе. Вокруг сосудов серого мозгового вещества обнаруживают диффузные скопления клеток, состоящие из лимфоцитов, плазмоцитов и гистиоцитов.

Выделение вируса проводят на культурах клеток. Для этого используют перевиваемую линию клеток СПЭВ или первичную культуру клеток ПЭС. Приготовленную по вышеописанной методике суспензию вносят по 0,1 мл не менее чем в 4 пробирки с клеточным монослоем. После адсорбции при 37ºС в течение 30 минут в каждую пробирку заливают поддерживающую среду в объеме 0,9 мл. Обычно вирус болезни Тешена требует определенное время для адаптации к культурам клеток, поэтому цитопатические изменения иногда могут отсутствовать или проявляться в поздние сроки инкубации. В этой связи на 7-й день культивирования вне зависимости от обнаруженных цитопатических изменений культуру однократно замораживают и оттаивают, после чего этим же материалом заражают свежие монослойные культуры (по 0,2 мл). Материал от одного образца материала пассируют подобным образом не менее 3 раз до появления выраженного ЦПД.

Цитопатические изменения, вызываемые вирусом, характеризуются скоплением в виде грозди округлившихся клеток с повышенной светопреломляемостью (рефрактильностью). При этом пораженные клетки отделяются от стекла с образованием стерильных пятен. Все описанные изменения становятся хорошо заметными на 3-5-й день после заражения. Аналогичные изменения на культурах клеток вызывают другие энтеровирусы свиней, выделяемый вирус идентифицируют серологическими реакциями.

Идентификацию вируса болезни Тешена проводят в РН на культурах клеток. Для этого используется методика постановки РН, в которой вирус одновременно изолируется, титруется и типируется в культурах клеток. Для выделения вируса используется первый ряд из 4 пробирок с культурами клеток, в которые вносят по 0,1 мл суспензии материала и 0,9 мл поддерживающей среды. Затем во втором ряду пробирок готовят последовательные десятикратные разведения материала от 10^-1 до 10^-5. После этого 0,5 мл каждого разведения переносят в 5 пробирок третьего ряда, куда добавляют по 0,5 мл инактивированной при 56ºС в течение 30 минут специфической сыворотки в рабочем разведении 1:1000. После 1,5-часового контакта при 37ºС смесью каждого разведения инокулируют по 4 пробирки с монослоем. Одновременно с заражением культуры клеток смесью суспензии и сыворотки проводят заражение пробирок с монослоем различными разведениями вируссодержащего материала без сыворотки.

При учете результатов подсчитывают количество пробирок, в которых обнаруживают через 48-168 часов характерные цитопатические изменения. Результат титрования считают положительным, если титр вируса без сыворотки составляет не ниже 3 lg, при отсутствии ЦПД во всех пробах, инокулированных смесью вируса и сыворотки. Одновременно с РН возможно идентифицировать вирус в РИФ по вышеописанной методике, однако первая имеет большее значение.

Ретроспективную серодиагностику проводят для постановки диагноза на прошедшую инфекцию, а также латентное вирусоносительство при помощи РН в культуре клеток почечной ткани свиньи. Серологическую диагностику инфекции проводят только в парных пробах сыворотки в связи со значительным числом здоровых серопозитивных животных (до 60%) и возможностью инфицирования свиней другими серовариантами вируса.

В реакции нейтрализации исследуют парные пробы сывороток крови животных, отобранные с интервалом 3-4 недели. Перед постановкой реакции сыворотки инактивируют при 56ºС в течение 30 минут и готовят двукратные разведения с 1:32 до 1:512 в объеме 0,5 мл, после чего к каждому разведению добавляют равный объем вируса из диагностического набора в рабочем разведении 1000 ТЦД₅₀ / 1 мл. После 1,5-часового контакта при 37ºС по 0,2 мл смеси каждого разведения вносят в 4 пробирки с культурами клеток, в которых ростовую среду предварительно меняют на 0,8 мл поддерживающей.

Постановку реакции сопровождают постановкой необходимых контролей: 1) контроль монослоя (4 пробирки с незараженной культурой клеток), 2) контроль вируса (по 4 пробирки, зараженных 100, 10, 1 и 0,1 дозой вируса), 3) контроль токсичности сыворотки (4 пробирки с культурой клеток, инокулированной сывороткой в разведении 1:32.

Учет реакции проводят на 4-е и 7-е сутки. Результат считают положительным при нарастании титра антител в парных пробах сыворотки крови в 4 и более раз или при обнаружении титров антител 1:32 и выше в 50% и более сывороток крови однократно исследованных животных.