Теоретическая справка

1 2 3 4 5 6 7

Тема №2. «Физиология микроорганизмов»

ЗАНЯТИЕ №6

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБОВ.

Цель занятий:

изучить основные биологические свойства аэробов и основные принципы их культивирования

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Особенности метаболизма бактерий.

2. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.

3. Питание бактерий.

4. Характеристика питательных сред.

5. Основные принципы культивирования аэробных бактерий.

6. Способы получения энергии.

Принципиальная схема лабораторной диагностики бактериальных инфекций

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• описать культуральные свойства;

• идентифицировать микроорганизмы

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:

О методах выделения чистых культур аэробов.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ

Выполните задания для самоконтроля:

СТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ

	Органоиды клетки	Функции
1.	Клеточная стенка
2.	ЦПМ
3.	Включения
4.	Рибосомы
5.	Липосомы
6.	Нуклеоид
7.	Жгутики
8.	Капсула
9.	Спора
10.	Плазмиды

Микроэлементы___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Белки____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Нуклеиновые кислоты__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Липиды__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Углеводы_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ПИТАНИЕ БАКТЕРИЙ.

Автотрофы________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Гетеротрофы______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Сапрофиты_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Паразиты_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Способы проникновения веществ в бактериальную клетку_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ БАКТЕРИЙ:

Вода__________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Микроэлементы________________________________________________________________________________________________________________________________________

Макроэлементы_________________________________________________________________________________________________________________________________________

ЗАНЯТИЕ №6

Работа № 1. Схема выделения и идентификации чистой культуры аэробов

Цель: разобрать и записать схему выделения и идентификации аэробов (под руководством преподавателя)

Теоретическая справка

Основные принципы выделения и идентификации чистых культур бактерий

Чистую культуру бактерий получают для проведения дифференциально-диагностических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизмов.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по характеру роста на питательной среде.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и питательную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens, золотистый пигмент -Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент - Pseudomas aeruginosa (синегнойная палочка).

Биохимические признаки бактерий определяются набором ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят исследования по выявлению антигена и чувствительности к фагам.

Работа № 2 Питательные среды

Цель: создать представление о питательных средах.

Теоретическая справка

1. Классификация питательных сред

Питательные среды необходимы для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения микроорганизмов в виде чистых культур в лабораторных и производственных условиях

По составу:

Естественные питательные среды - это натуральный продукт животного или растительного происхождения - молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови.

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

Синтетические среды содержат определенные химические соединения в точно указанных концентрациях.

По консистенции:

Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур.

Плотные - для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др. Агар - полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гели, плавящиеся при 100°С и уплотняющиеся при 45°С и ниже, не используемые микроорганизмами в качестве питательного субстрата. Несколько циклов плавления и затвердевания не влияют на способность агара образовывать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать. Агар к средам добавляют в количестве 1,5-2% - для плотной среды.

По назначению:

Среды общего назначения используют для культивирования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), сусло жидкое, сусло-агар.

Элективные среды используют при выделении определенного вида микроорганизмов из мест его естественного обитания или получения накопительных культур. Сопутствующие микроорганизмы или совсем не растут на таких средах, или развитие их сильно задерживается. Например, Желточно-солевой агар (ЖСА), теллуритовый агар и др.

Дифференциально-диагностические среды (ДДС) (например, среды Гисса. Эндо, Плоскирева и др.) предназначены для изучения и индикации отдельных типов, видов и групп бактерий. Основой среды являются различные органические и неорганические соединения, дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами. При их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону. Соответственно выделяют среды с углеводами и спиртами. среды с мочевиной, среды для определения индоло-образования. среды для определения протеолитической активности и политропные, или комбинированные, среды.

На дифференциально-диагностических средах изучается ферментативная активность микроорганизмов

2. Состав некоторых питательных сред

• Кровяной агар (для выявления микроорганизмов, вызывающих гемолиз). К расплавленному и охлажденному до 45 °С МПА (2% агара) стерильно добавляют 5-10% дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана.

• Пептонная вода. Основной раствор пептона: пептона - 100 г, хлорида натрия -50 г, нитрата калия - 1 г, карбоната натрия - 25 г, воды дистиллированной - 1 л; рН 9,0. Стерилизуют при 120°С 20 мин. Для получения пептонной воды основной раствор разводят водой в 10 раз, доводят рН до 8,8 -8,9, стерилизуют. Используют для культивирования холерных вибрионов.

• Свернутая сыворотка. Кровь берут от крупных животных. В продаже имеется стерильная нормальная сыворотка крови животных для бактериологических питательных сред, расфасованная по 250 мл. Можно пользоваться человеческой сывороткой (отходами производства гамма-глобулина), остатками крови при постановке реакции Вассермана и других серологических реакций.

• Среды Гисса с углеводами. Пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде - 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4. Дифференциально-диагностическая среда, на которой выявляют разложение углеводов микроорганизмами.

• Мясопептонный агар (МПА). К готовому МПБ добавляют 2% агар и оставляют для набухания 30 мин. Кипятят до полного растворения агара. Стерилизуют 30 мин при 120°С. Применяют для выращивания большинства сапрофитных бактерий.

Асцитический агар. Некоторые патогенные бактерии могут расти только на среде, содержащий человеческий белок. Для культивирования этих микробов приготовляют асцит-агар и асцит-бульон. На 2-3 части мясопептонной среды добавляют 1 часть асцитической жидкости. (Асцитической жидкостью называют серозную жидкость, которая скапливается в брюшной полости при заболеваниях сердца и некоторых других заболеваниях и которую удаляют с лечебными целями.)

• Среда 199. Синтетическая среда, содержащая аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли. Для выращивания клеток (как ростовую) среду используют с добавлением 5-10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток.

• Среда Эндо (готовят непосредственно перед употреблением). К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70 °С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного

10 % раствора сульфата натрия. Дифференциально-диагностическая среда для культивирования бактерий кишечной группы.

• Среда Плоскирева (бактоагар Ж) выпускается в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Эта среда является не только дифференгщально-диагаостической, но и селективной, так как подавляет рост микроорганизмов (кишечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некоторых патогенных бактерий (возбудители брюшного тифа, паратифов, дизентерии). Лактозоотрицательные образуют на этой среде бесцветные колонии, лакгозоположительные - красные.

• Среда Левенштейна-Йенсена. Д ля приготовления этой среды в 600 мл дистиллированной воды, содержащей 12 мл глицерина, растворяют: аспарагина 3,6 г, фосфата калия однозамещенного 2,4 г, сульфата магния 0,24 г, цитрата магния 0,6 г, картофельной муки 5 г, малахитового зеленого 0,4 г. Полученную смесь стерилизуют 15 мин при 120 °С. Приготовляют 1000 мл однородной суспензии из свежих яиц. Добавляют стерильно в яичную взвесь основной солевой раствор, подогретый до 45-60°С, тщательно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки и оставляют для свертывания в наклонном положении при 85°С 45 мин.

Желточно - солевой агар (ЖСА) содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8-10%), которые не препятствуют размножению стафилококков, что обеспечивает элективность среды. Среда позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу, от стафилококков, не выделяющих данный фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитиназоположительных видов. Готовят среду из питательного солевого агара В расплавленный и остуженный до 45 ⁰С агар добавляется куриный желток.

Требования, предъявляемые к питательным средам:

1.__________________________________________________________________________

2.__________________________________________________________________________

3.__________________________________________________________________________

4.__________________________________________________________________________

5.__________________________________________________________________________

Самостоятельная работа: классифицировать предложенные питательные среды. Результаты оформить в виде таблицы

среда	происхождение	консистенция	Назначение
	Естеств.	Искусств.	жидкие	полужидкие	плотные	общего	ДДС	Элективные
Мясопептон ный агар (МПА)
Мясопептонный Бульон (МПБ)
Среда Эндо
Кровяной агар
Пептонная вода
Среда Гиса
Среда 199
Свернутая сыворотка
Желточно солевой агар (ЖСА)

Работа № 3. Характер роста бактерий на плотных питательных средах (дифференциально-диагностические признаки)

Цель: изучить характер роста бактерий на основных и дифференциально-диагностических средах.

Самостоятельная работа: изучить культуральные свойства микроорганизмов на плотных средах.

Критерии	МПА
Форма
Размер
Характер края
Пигмент (цвет)
Поверхность
Прозрачность
Структура
Консистенция

Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 4. Характер роста бактерий на жидких питательных средах (дифференциально-диагностические признаки)

Цель: изучить характер роста бактерий на жидких питательных средах. Самостоятельная работа: изучить особенности роста микроорганизмов, результат оформить в виде рисунка, сделать вывод

Опыт №1 Опыт №2 Опыт №3

МПБ МПБ 1% пептонная вода

(кишечная палочка) (возбудитель сибирской язвы) (возбудитель холеры)

Вывод :_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Подпись преподавателя______________________________________________________________

ЗАНЯТИЕ №7.

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБОВ.

Цель занятий:

изучить основные биологические свойства аэробов и основные принципы их культивирования

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

2. Особенности метаболизма бактерий.

3. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.

4. Питание бактерий.

5. Характеристика питательных сред.

6. Основные принципы культивирования аэробных бактерий.

7. Способы получения энергии.

8. Биохимическая активность аэробных бактерий

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• описать биохимические свойства;

• идентифицировать микроорганизмы

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:

О методах выделения чистых культур аэробов.

Работа № 1. Техника посева на жидкие и плотные питательные среды

Цель: ознакомиться с техникой посева на плотные и жидкие питательные среды и указать значение метода.

Теоретическая справка

Выделение чистой культуры аэробных бактерий

1. Методы, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов. Техника посева

Рассев шпателем по Дригальскому.

Техника посева. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й - минимальное. Этот метод применяется для получения изолированных колоний и чистой культуры микроорганизма.

• Рассев петлей по Дригальскому (посев штрихами).

Техника посева. Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый материал петлей вносят в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии.

• Метод фильтрации.

Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделение содержащихся микроорганизмов по величине.

Этот метод применяется для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).

2. Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов

• Метод Шукевича.

Техника посева. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды дают «ползущий» рост по скошенному агару. Для получения чистой культуры ее отсевают с верхнего края посева.

• Метод прогревания. Позволяет отделить спорообразующие бациллы от не споровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. Вегетативные формы погибают, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.

• Бактериостатический метод (метод ингибирования). Основан на избирательном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Например, антибиотики позволяют очистить исследуемый вируссодержащий материал от сопутствующей бактериальной флоры. Серная кислота (5% р-р) быстро убивает большинство бактерий, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях.

Метод заражения лабораторных животных или растений. Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или сорта растений.

После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении в изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным

Самостоятельная работа: апробировать различные методы посевов:

Название

Рисунок

Значение

Седиментации по Коху