Особенности неинвазивного количественного анализа биологических объектов

Рассмотрение оптических эффектов, возникающих при взаимодействии света с биологическим субстратом, показывает большие возможности оптической информации для оценки состояния биообъектов. Исследователей всегда интересовала возможность установления соотношений между физиологическим состоянием живого организма и его физико-химическими (в том числе и оптическими) свойствами. Поскольку интактные клетки, как правило, являются многокомпонентными гетерогенными сильно рассеивающими непрозрачными объектами с целым рядом специфических оптических эффектов, то необходимо рассмотреть их влияние на особенности получения информации, что крайне важно при количественных измерениях в решении перечисленных выше проблем.

Анализ современных методов исследования показывает, что получение информации из таких объектов как нативные клетки перспективно осуществлять через регистрацию изменений в электромагнитном излучении при его взаимодействии с объектом. Подчеркнем еще раз, что эти объекты, как правило, многокомпонентны гетерогенны сильно рассеивают свет (могут быть непрозрачными), вести же анализ без их разрушения необходимо еще и по слоям (например, для определения градиентов концентрации тех или иных компонентов или градиентов степени их пространственной организации). Наиболее полно перечисленным выше требованиям отвечают методы спектроскопии внутреннего отражения.

Любой метод анализа требует знания количества прореагировавшего с электромагнитным излучением образца. Следовательно, одним из самых важных вопросов подобного анализа является разработка методов количественного определения характеристик и параметров этого образца. Особенностью при количественном анализе параметров исследуемых объектов методами внутреннего отражения (в том числе и нарушенного полного внутреннего отражения - НПВО) является зависимость эффективных оптических свойств среды, представляющей совокупную систему (состоящую, например, из клеток, воздуха, жидкой среды и т.д.), от объема прореагировавшего с электромагнитным излучением вещества или же от объема заполненного объектами пространства на измерительном элементе. Для решения сформулированных задач предлагаем следующие подходы.

1. В основу первого способа был положен принцип "подходящего индикатора": если к нанесенным на рабочую поверхность ИЭ неразрушенным клеткам добавить известное количество другого вещества, то разность показаний оптических плотностей в аналитической полосе индикатора при отсутствии интактных клеток и в их присутствии пропорциональна концентрации (объему) вещества клеток или же объему межклеточного пространства (параметры ИЭ изначально известны). В качестве индикатора при работе с интактными клетками были использованы нейтральные вещества.

2. Известно, что явление полного внутреннего отражения (ПВО) наступает при падении светового потока на границу раздела "измерительный элемент - образец" под углом θ, большим критического угла падения θкр. При этом световой поток проникает в анализируемый образец на некоторую величину d (глубина проникновения). Величина d пропорциональна той части образца, которая прореагировала со светом и которую определяют как эффективную толщину d_эф. Она связана с оптической плотностью D = α·N·d, где α - показатель поглощения образца, N - число отражений светового потока в ИЭ. Определить θкр можно из выражения sinθ_кр = n₂₁ = n₂ / n₁, где n₁ и n₂ - показатели преломления материала измерительного элемента и образца, соответственно. Для воздуха n =1,0, а для стенок клеток примерно 1,5. Тогда θ воздуха составляет 40º, а для клеток - 52º. Следовательно, при изменении угла падения от 0 до 90º ПВО для воздуха наступает при меньших углах падения, чем для клеток, контактирующих с рабочей поверхностью ИЭ. Поэтому интенсивность светового потока на выходе ИЭ при углах падения, меньших критического для образцов, будет пропорциональна объему незаполненного пространства образцом на ИЭ. Это объясняется тем, что при углах, меньших критического, имеет место явление преломления, и световой поток в ИЭ не возвращается. Зная же параметры ИЭ, определяем объем прореагировавшего со светом образца.

3. Если же наблюдать с помощью микроскопа рассеянный клетками световой поток со стороны рабочей поверхности измерительного элемента для углов падения, близких к критическому, при прохождении света из ИЭ в интактные клетки на длине волны, где нет поглощения, то можно также говорить о нарушении ПВО, но не за счет поглощения света веществом, а за счет рассеяния в этом режиме работы. Измеряемой характеристикой здесь является рассеянный световой поток (попадающий в объектив микроскопа), который должен быть пропорционален заполнению рабочей поверхности ИЭ, т.е. объему прореагировавшего со светом образца.

Т.к. размер рабочей поверхности ИЭ, а также глубина проникновения светового потока в образец известны, то искомый результат получается в обоих случаях. Однако экспериментально легче вести регистрацию получаемой информации, с нашей точки зрения, на выходе ИЭ. Эти два способа мы назвали амплитудными, предлагаем также - фазовый способ.

4. При использовании поляризованного светового потока, распространяющегося в ИЭ, при каждом отражении его от границы "ИЭ - образец" скачком изменяется фаза параллельной и перпендикулярной составляющих вектора напряженности электрического поля. Причем размер этого сдвига фаз различен для каждой составляющей и зависит от разности показателей преломления совокупной измеряемой системы и ИЭ, а также от угла падения светового потока. При отсутствии образца показатель второй среды постоянен (скажем, для воздуха). Следовательно, разность фаз также постоянна. При наличии образца на части рабочей поверхности ИЭ изменяется показатель преломления. При этом изменяются сдвиги фаз каждой из составляющих электрического вектора и соответственно их разность, которая и является мерой объема прореагировавшего со светом вещества.

Анализ литературы показал, что для определения объема прореагировавшего с электромагнитным излучением биологических образцов методы, основанные на нарушении ПВО, в количественном анализе использованы не были. Поэтому прежде, чем предложить экспериментальный материал, проведем теоретический анализ прохождения света из ИЭ в объекты анализа и его возможного последующего изменения в зависимости от угла падения объекта, его показателя преломления и формы контакта поверхности образца и рабочей поверхности ИЭ, т.е. теоретически обоснуем возможность определения объема прореагировавшего с электромагнитным излучением вещества, что является решающим при количественном анализе. Для этого рассмотрим возможность применения различных моделей, которые используем для анализа изменений интенсивности электромагнитного излучения на выходе элемента НПВО (или многократного НПВО - МНПВО) в зависимости от формы интактных клеток, их размеров, а также от вида поляризации светового потока.