Вопросы получения и обработки информации

В обычной спектроскопии важной операцией является подготовка образца для исследования. За исключением тех случаев, когда образцы можно использовать непосредственно, техника подготовки образцов (измельчение, таблетирование и т.д.) не только сложна и требует навыка, но такая подготовка, связанная, в том числе, с повреждением (или даже разрушением) образца (прежде всего это касается интактных клеток), неминуемо приводит к потере информации.

В спектроскопии НПВО единственно необходимая подготовительная операция - это помещение образца (будь то жидкость, твердое тело с неровной поверхностью или порошок) у рабочей поверхности ИЭ. Поэтому объект может изучаться в своем естественном состоянии, без какой-либо дополнительной подготовки. Конечно, такая формулировка несколько упрощает действительное положение: иногда сложность решаемых задач требует специальной подготовки образца, что будет дальше продемонстрировано в экспериментальном материале. По мнению специалистов успех в решении проблемных вопросов будет определяться также и изобретательностью исследователя при подготовке образца.

Для получения контрастных спектров, например, требуется, как уже было сказано, обеспечить контакт между ИЭ и исследуемым образцом. Обеспечить такой контакт между клетками и ИЭ в жидкой среде не просто, так как наличие вокруг клеток слоя воды, который представляет собой стерический барьер, препятствует адсорбции клеток на рабочие поверхности ИЭ. Отрицательное влияние этого барьера достаточно хорошо показано. Удаление воды приводит к адсорбции там, где ее не было. Опыт работы по использованию спектроскопии НПВО для исследования состояния различных микроорганизмов в процессе ферментации показывает, что после подсушивания водной среды, в которой находятся микроорганизмы, на поверхности ИЭ, выполненных из самых различных материалов (например, германия, кремния, инфракрасных стекол, материалов типа КО-2 и т.д.), микроорганизмы прочно прикрепляются к рабочим поверхностям этих элементов, хотя до подсушивания адсорбции не было.

Необходимый контакт между исследуемым объектом и рабочей поверхностью ИЭ обеспечивали следующим образом. Объекты, находящиеся в жидкой среде, наносились на рабочие поверхности ИЭ и производилось подсушивание в вытяжном шкафу в токе воздуха при комнатной температуре. Как уже было отмечено, испарение жидкости обеспечивало хороший контакт между рабочими поверхностями и исследуемыми объектами. Весь этот процесс подготовки образца занимает не более 10 мин. Затем измерительный элемент устанавливался в приставку, находящуюся в кюветном отделении спектрофотометра, и производилась запись спектра. Проверка на выживаемость микроорганизмов проводилась по принятой в микробиологии методике. Подчеркнем, что при использовании предлагаемых методов объект может изучаться в своем естественном состоянии без какой-либо дополнительной подготовки.

Исключительно сложный коллоид, каким является цитоплазма микроорганизма, содержит большое число веществ, в той или иной степени поглощающих инфракрасные лучи. Для каждого из них характерны свои полосы поглощения в тех или иных участках спектра. Сливаясь, полосы поглощения различных веществ дают бедный деталями спектр, в котором четко выделяется лишь определенное число полос, общих для большинства составных частей клетки. При сравнении спектральных характеристик нативных клеток обращают внимание на следующие области:

1. 2800 - 3000 смˉ¹: 2970 - полоса антисимметричных валентных колебаний СН в СН₃ группе; 2930 - полоса антисимметричных валентных колебаний СН в СН₂ -группе; 2870 - полоса симметричных валентных колебаний СН в СН₃ -группе; 2850 - полоса симметричных валентных колебаний CH в CH₂ - группе.

2. 1500 - 1800 смˉ¹: 1730 - 1740 - полоса смешанных валентных колебаний в неионизированной карбоксильной группе и эфирах; 1650 - 1660 или амид 1 - полоса, главным образом, валентных колебаний С=0 в пептидной группе; 1540 - 1550 или амид 2 - полоса, главным образом, смешанных деформационных колебаний N-H и валентных колебаний C-N и C=0 в пептидной группе.

3. 1400 - 1500 смˉ¹: 1450 - полоса антисимметричных деформационных колебаний C-CH₃; полоса 1410; 1380 - полоса симметричных деформационных колебаний С-СН₃.

4. 1200 - 1400 смˉ¹: полосы 1250 и 1330.

5. 1000 - 1200 смˉ¹: полосы 1150 - 1160, 1100, 1035, 1000 и 970.

Кроме того, валентные колебания N-H связи дают сильную полосу около 3300 смˉ¹. Интенсивность поглощения полос спектра различных микроорганизмов определяется соотношением основных биохимических компонентов клетки: белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов.

Интенсивности полос 2930, 1740 и 1460 смˉ¹ связаны с липидными компонентами микроорганизмов. Полосы поглощения в области 1100 смˉ¹ и ниже характеризуют наличие в микробной клетке углеводов. Две сильные полосы с частотами максимумов около 1240 и 1080 смˉ¹ обусловлены присутствием фосфорорганических соединений, в том числе - нуклеиновых кислот. Все другие колебания, связанные с наличием в микробных клетках нуклеиновых кислот, имеют полосы гораздо слабее по интенсивности. Полоса поглощения 1660 смˉ¹ соответствует в основном белкам, полипептидам и солям аминокислот, хотя небольшой вклад могут внести и нуклеиновые кислоты и полисахариды. Более специфичной только для белков является полоса в пределах 1550 смˉ¹ и частично 1400 смˉ¹. Полоса поглощения 3300 смˉ¹ также соответствует в основном белкам. Специальные исследования показали, что интенсивность этой полосы мало зависит от вида и биохимических особенностей микроорганизмов. Но именно потому, что в спектрах микроорганизмов присутствует определенное число полос, общих для большинства составных частей клетки, ценность их для анализа многокомпонентных сред велика. Если надо установить, например, в пробе пыли наличие частиц белкового происхождения, то можно воспользоваться анализом полос поглощения в области 1550, 1660 и 3300 смˉ¹, так как все белки имеют характерные полосы поглощения в этих областях, а почти все неорганические частицы в указанных областях не поглощают. Наличие в спектре исследуемой пробы названных полос поглощения почти с достоверностью свидетельствуют о присутствии белка. Эта зависимость настолько четкая, что целесообразно построить калибровочный график для получения абсолютных данных о весовом содержании в данной пробе микробной массы или отдельных ее компонентов. Но прежде, чем мы сможем построить подобные графики, необходимо остановиться на вопросах обработки получаемой информации.