Определение изоэлектрической точки белков

Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка. Высаливание белков

Высаливанием называется процесс выделения белков из водных растворов нейтральными растворами концентрированных солей щелочных и щелочноземельных металлов. При добавлении больших концентраций солей к раствору белка происходит дегидратация белковых частиц и снятие заряда, при этом белки выпадают в осадок. Степень выпадения белков в осадок зависит от ионной силы раствора осадителя, размера частиц белковой молекулы, величины ее заряда, гидрофильности.

Разные белки осаждаются при различных концентрациях солей. Поэтому в осадках, полученных путем постепенного повышения концентрации солей, отдельные белки находятся в различных фракциях. Высаливание белков является обратимым процессом, и после удаления соли белок вновь приобретает природные свойства. Поэтому высаливанием пользуются в клинической практике при разделении белков сыворотки крови, а также при изолировании, очистке различных белков.

Исследуемый материал: яичный белок.

Реактивы: насыщенный (NH₄)₂SO₄, измельченный порошок (NH₄)₂SO₄, 10%-ный раствор NaOH, 1%-ный раствор CuSO_4.

Оборудование: пробирки, пипетки.

ХОД РАБОТЫ. В пробирку наливают 20 капель неразведенного яичного белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, содержимое перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, выпадает осадок яичного глобулина. Через 5 мин осадок отфильтровывают. В фильтрате остается другой белок – яичный альбумин. Для высаливания альбумина к фильтрату добавляют измельченный порошок сульфата аммония до полного насыщения, то есть до тех пор, пока не прекратится растворение соли. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка.

Оформление. Результаты работы заносят в таблицу.

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКА ВЫСАЛИВАНИЕМ

Изоэлектрической точкой белка называется определенная величина рН среды, при которой белок находится в виде нейтральных молекул (в изоэлектрическом состоянии), несущих равные количества положительных и отрицательных зарядов. При других концентрациях ионов водорода в растворе имеются преимущественно положительные и отрицательные ионы белка. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы и легко выпадают в осадок.

Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральной среде, но не вполне совпадает с ней, для многих белков она сдвинута в кислую сторону, а некоторые белки имеют изоэлектрическую точку при слабощелочной реакции среды. Определение изоэлектрической точки может быть сведено к определению рН раствора, при котором наблюдается наиболее быстрое и полное выпадение белка в осадок.