Биофизика белка. Биологические функции белков

Все процессы в клетке осуществляются при участии белков. Их функции чрезвычайно многообразны. Каждый данный белок как вещество с определенным химическим строением выполняет одну узкоспециализированную функцию и лишь в нескольких отдельных случаях – несколько взаимосвязанных.

Спускаясь от клеточного до молекулярного уровня мы встречаемся со следующими основными функциями белков:

1.Каталитическая (ферментативная) функция: Многочисленные биохимические реакции в живых организмах протекают в мягких условиях при температурах, близких к 40°С, и значениях рН близких к нейтральным. В этих условиях скорости протекания большинства реакций ничтожно малы, поэтому для их приемлемого осуществления необходимы специальные биологические катализаторы – ферменты. Даже такая простая реакция, как дегидратация угольной кислоты:

CO₂ + H₂O HCO₃^-+ H⁺

катализируется ферментом карбоангидразой. Вообще все реакции, за исключением реакции фотолиза воды 2H₂O®4H⁺ + 4e^- + O₂, в живых организмах катализируются ферментами. Как правило, ферменты – это либо белки, либо комплексы белков с каким-либо кофактором – ионом металла или специальной органической молекулой. Ферменты обладают высокой, иногда уникальной, избирательностью действия. Например, ферменты, катализирующие присоединение a-аминокислот к соответствующим т-РНК в процессе биосинтеза белка, катализируют присоединение только L-аминокислот и не катализируют присоединение D-аминокислот.

2. Транспортная функция белков. Белки служат для запасания и переноса кислорода (гемоглобин, гемоцианин). Эта функция напоминает ферментативную, но она отлична от нее, т.к. О₂ не претерпевает изменений.

Внутрь клетки должны поступать многочисленные вещества, обеспечивающие ее строительным материалом и энергией. В то же время все биологические мембраны построены по единому принципу – двойной слой липидов, в который погружены различные белки, причем гидрофильные участки макромолекул сосредоточены на поверхности мембран, а гидрофобные “хвосты” – в толще мембраны. Такая структура непроницаема для таких важных компонентов, как сахара, аминокислоты, ионы щелочных металлов. Их проникновение внутрь клетки осуществляется с помощью специальных транспортных белков, вмонтированных в мембрану клеток.

3. Регуляторные функции - низкомолекулярные полипептиды (инсулин, окситоцин), гормоны стимулируют функциональную активность в клетках других тканей и органов.

4. Защитная иммунологическая функция. Иммунная система обладает способностью отвечать на появление чужеродных частиц выработкой огромного числа лимфоцитов, способных специфически повреждать именно эти частицы, которыми могут быть чужеродные клетки, например патогенные бактерии, раковые клетки, надмолекулярные частицы, такие как вирусы, макромолекулы, включая чужеродные белки. Одна из групп лимфоцитов – В-лимфоциты, вырабатывает особые белки, выделяемые в кровеносную систему, которые узнают чужеродные частицы, образуя при этом высокоспецифичный комплекс на этой стадии уничтожения. Эти белки- иммуноглобулины высших организмов, защищают их от чужеродных биополимеров за счет своего специфического строения (функциональной группы).

5. Функция хранения, передачи химических и электрических сигналов.

6. Структурная функция. Наряду с белками, выполняющими тонкие высокоспециализированные функции, существуют белки, имеющие в основном структурное значение. Они обеспечивают механическую прочность и другие механические свойства отдельных тканей живых организмов. В первую очередь это коллаген - основной белковый компонент внеклеточного матрикса соединительной ткани. У млекопитающих коллаген составляет до 25% общей массы белков. В эластичных тканях - коже, стенках кровеносных сосудов, легких - помимо коллагена внеклеточный матрикс содержит белок эластин, способный довольно в широких пределах растягиваться и возвращаться в исходное состояние.

Еще один пример структурного белка - фиброин шелка, выделяемый гусеницами шелкопряда в период формирования куколки и являющийся основным компонентом шелковых нитей.

7. Двигательные белки. Мышечное сокращение является процессом, в ходе которого происходит превращение химической энергии, запасенной в виде макроэргических пирофосфатных связей в молекулах АТФ, в механическую работу. Непосредственными участниками процесса сокращения являются два белка - актин и миозин.

8. Рецепторная функция. Большое значение, в особенности для функционирования многоклеточных организмов, имеют белки-рецепторы, вмонтированные в плазматическую мембрану клеток и служащие для восприятия и преобразования различных сигналов, поступающих в клетку, как от окружающей среды, так и от других клеток. В качестве наиболее исследованных можно привести рецепторы ацетилхолина, находящиеся на мембране клеток в ряде межнейронных контактов, в том числе в коре головного мозга, и у нервно-мышечных соединений. Эти белки специфично взаимодействуют с ацетилхолином и отвечает на это передачей сигнала внутрь клетки. После получения и преобразования сигнала нейромедиатор должен быть удален, чтобы клетка подготовилась к восприятию следующего сигнала.

9. Токсины: Ряд живых организмов в качестве защиты от потенциальных врагов вырабатывают сильно ядовитые вещества - токсины. Многие из них являются белками, однако, встречаются среди них и сложные низкомолекулярные органические молекулы. В качестве примера такого вещества можно привести ядовитое начало бледной поганки - a-аманитин: Это соединение специфично блокирует синтез эукариотических и-РНК. Для человека смертельной дозой является несколько мг этого токсина.

Первичная и вторичная структура белков. Белки не являются статическими образованиями. Это структуры, которые могут претерпевать определенные конформационные изменения в процессе биологического функционирования. Анализ конформаций проводят исходя из различных уровней организации бел­ковых молекул. Еще в 1959 г К.Линдерстрем-Ланг выделил четыре уровня структурной организации белков - первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуру. Позже на основании сопоставления данных рентгеноструктурного анализа, калориметрии и других методов были выделены еще два уровня организации - сверхвторичные структуры и домены белков.

Аминокислотную последовательность называют первичной структурой белка. Изучение расположения аминокислот в белках представляет важный этап в изучении структуры белка. В настоящее время этот анализ проводится автоматически с помощью приборов секвинаторов. В последние годы используется новый метод определения аминокислотной последовательности. Выделяют фрагмент ДНК, содержащий структурный ген данного белка, расшифровывают после­довательность нуклеотидов и переводят ее согласно генетическому коду в аминокислотную последовательность. Первичная структура - это одномерное представление белковой молекулы. Знание первичной структуры используется для предсказания вторичной и третичной структуры белка. Одновременное использование аминокислотной последовательности и кристаллографических карт электронной плотности позволяет восстановить пространственное расположение всех атомных групп в белке.

В полипептидной цепи пептидная группа является плоской и жесткой. Полипептидную цепь можно представить как последовательность однотипных плоскостей (пептидных групп), соединенных между собой одинарными связями. Вращение вокруг этих связей не является полностью свободным вследствие стерических ограничений. Угол поворота вокруг связей С – С_а обозначают ψ, а угол поворота вокруг связей N – С_а обозначают φ. Г.Рамачандран провел расчеты конформационных состояний полипептидной цепи с помощью ЭВМ и определил область возможных значений ψ и (графики Рамачандрана или конформационные карты). На конформационных картах значения углов ψ и φ в белках не являются произвольными, они четко ограничены конкретными областями, что свидетельствует о существовании ограни­ченного количества конформаций полипептидной цепи.

Под вторичной структурой белка понимают упорядоченное расположение полипептидной цепи, стабилизированное водородными связями между пептидными группами. Рассматривая этот структурный уровень, говорят о локальной конформации участков полипептидной цепи. Часто встречаемой и наиболее энергетически и стерически выгодной вторичной структурой является правая α– спираль, которая впервые была постулирована Л.Полингом и Р.Кори (1951)_. Наиболее важные характеристики α– спирали: 1) число аминокислотных остатков на один шаг спирали составляет 3,6; 2) шаг спирали d = 0,54 нм; 3) трансляция на один остаток вдоль спирали Δd = 0,15 нм; 4) радиус α– спирали r = 0,23 нм; 5) водородные связи (параллельные оси спирали) образуются между каждой первой и четвертой пептидной группой; 6) для α– спирали φ = -57° и ψ = -47°. Как видно из поперечного среза α– спирали на каждом обороте ее происходит сдвиг вправо на 60°. В результате такого сдвига только через 10 оборотов 1-я пептидная группа точно будет совпадать с 36-й пептидной группой.

Вторичными структурами белковых молекул являются параллельные и антипараллельные β-складчатые листы (или β-структура). На конформационной карте Рамачандрана для β-слоя с антипараллельными цепями φ = -139° и ψ = +135°_, для β-слоя с параллельными цепями φ = - 119° и ψ = +113°. Большинство из них имеют не более шести полипептидных цепей, стабилизированных водородными связями, и по шесть аминокислотных остатков по длине каждой цепи. Размеры такого листа: ширина t = 2,5 нм, длина l = 2,0 нм. Большинство складчатых листов имеют скрученную форму. Скручивание идет перпендикулярно вытянутым цепям.

Следующим уровнем организации белковых молекул являются сверхвторичные структуры. Примером таких структур является суперспиральные структуры. В них две α– спирали (в тропомиозине, легком меромиозине, парамиозине) или три α -спирали (в фибрино­гене) скручены друг относительно друга. Шаг суперспирали в легком меромиозине составляет α= 18,6 нм. На примере тропомиозина с известной аминокислотной последовательностью сделан вывод о том, что суперспираль стабилизируется гидрофобными взаимодействиями между отдельными α -спиралями.

Первичная структура цепи и формирование белковой глобулы

Одной из важнейших проблем физики белка является проблема связи между первичной структурой полипептидной цепи и пространственной строением глобулы. Биологически функциональна нативная пространственная структурa макромолекул, а генетически кодируется первичная структура. И почему молекула белка образует глобулу, по другому говоря, почему белок способен к самосборке и белок в этом состоянии уже может выполнять свои функции? Как было установлено Гуццо, для пространственной структуры белка имеет значение конкретное расположение аминокислот. Различают аминокислоты «неспиральные» не могут образовывать спирали и «спиральные» - могут изгибаться (асп, цис, тир, сер). От этого зависит закрученность, укладка молекулы. И еще особо важное значение для образования пространственной структуры белка имеет аминокислота глицин - это как универсальный шарнир может занимать самые различные положения.

В настоящее время предполагается, что самоорганизация белковой глобулы, не есть результат некого направленного процесса. Многие исследователи считают, что программа безошибочной самоорганизации закодирована в самой первичной структуре. Самоорганизация происходит стадийно, так что на каждом следующей стадии формируется все более сложная и стабилизированная структура.

Регулярные конформации полипептидных цепей, стабилизированные водородными связями (α и β – формы) устойчивы лишь в определенных условиях, Изменение температуры, рН, растворителя среды приводит к переходам конформации. Американец Доти устано­вил, что переходы спираль-клубок протекают за очень короткое время. Переход характеризуется изменением вязкости, светорассеивания и т.д. Резкость перехода свидетельствует о кооперативном характере, т.е. каждое звено макромолекулы находится в закрепленном состоянии с помощью водородных связей. При действии посторонних факторов происходит изменение упаковки молекул, т.е. конформации.

Согласно ученому Птицину на первой стадии в развернутой белковой цепи образуются флуктурующие (измененные, непостоянные) зародыши спиральных участков с вытянутой структурой (места образ.). На второй стадии одна или несколько пар заро­дышей объединяются, образуя центры организации третичной струк­туры. На третьей стадии происходит рост центров за счет присоединения соседних участков цепи.

И на последней, четвертой стадии образуется единая компактная структура глобулы путем роста или объединения нескольких центров.

Домены и третичная структура белка

Третичная структура белка представляет собой термодинамически наиболее стабильную форму свертывания и укладки полипептидной цепи. Возникает вопрос, как происходит свертывание белка, каким образом одномерная информация, заложенная в последовательности аминокислот, реализуется в пространственную информацию? Эксперименты по денатурации и ренатурации белков показали, что процессы разру­шения и образования компактной третичной структуры проходят достаточно быстро: нуклеаза стафилококков повторно свертывается за 1 с.

Для объяснения процесса свертывания используется нуклеационная модель. В этой модели допускается, что короткие сегменты полипептидной цепи очень быстро свертываются независимо друг от друга, а на втором этапе они сближаются, образуя компактную трехмерную структуру. Сегменты белка образуют α -спирали и β-слои с большой скоростью. Экспериментально показано, что переходы спираль - клубок проходят за время от 10^-6 до 10^-8 c.

В последнее время в белках выделен еще один важный уровень структурной организации. Анализ карт электронной плотности белков с молекулярной массой больше 20 000 показал, чтo белки состоят из нескольких глобулярных областей, слабо связанных между собой. Эти области получили название доменов. Индивидуальные домены часто можно выделить из белка с помощью протеолитических ферментов без потери ими функциональных свойств. Под доменом подразумевают область одной полипептидной цепи, заключенной в компактном объеме. Это такие участки цепи, которые свертываются и развертываются в белке независимо друг от друга.

Домен можно рассматривать как относительно автономную структурную единицу. С помощью сканирующей микрокалориметрии Привалов показал наличие в сложных белках отдельных кооперативных блоков, для которых характерны скачкообразные структурные переходы при тепловой денатурации. Оказалось, что во многих случаях такие кооперативные белки хорошо соответствует выделенным протеолитическим фрагментам белков. Это позволило идентифицировать кооперативные блоки с доменами белков. Часто выделенные протеолитические фрагменты имеет структурные свойства, подобные кооперативным блокам, т.е. совпадают их температуры плавления и энтальпии переходов, а также они сохраняют функциональные характеристики нативных белков. Домены связаны между собой очень ограниченным количеством пептидных связей, которые сравнительно легко разрываются под действием протеолитических ферментов.

В настоящее время с помощью сканирующей микрокалориметрии электронной микроскопии, протеолитического расщепления установлено доменное строение в таких высокомолекулярных белках, как иммуноглобулин, миозин, фибриноген и др.

Домены могут представлять собой важные промежуточные образования в процессе свертывания нативной структуры белков. Белки, состоящие из доменов, должны иметь более гибкую структуру, чем белки, в которых различные участки скреплены между собой. По-видимому, обратимые конформационные изменения, влияющие на функцию ферментов, связаны с междоменными перестройками без изменения структурной стабильности самих доменов.

Гипотеза расплавленной глобулы. Одним из способов изучения свора­чивания полипептидной цепи в трехмерную структуру является денатурация и последующая ренатурация белковой молекулы.

Опыты К. Анфинсена с рибонуклеазой однозначно показывают возмож­ность сборки именно той пространственной структуры, которая была наруше­на в результате денатурации.

В данном случае восстановление нативной конформации не требует нали­чия никаких дополнительных структур. Какие же модели свертывания поли­пептидной цепи о соответствующую конформацию являются наиболее веро­ятными? Одной из распространенных гипотез самоорганизации белка являет­ся гипотеза расплавленной глобулы. В рамках этой концепции выделяют не­сколько этапов самосборки белков.

1. В развернутой полипептидной цепи с помощью водородных связей и гидрофобных взаимодействий образуются отдельные участки вторичной структуры, служащие как бы затравками для формирования полных вторич­ных и супервторичных структур.

2. Когда число этих участков достигает определенной пороговой величи­ны, происходит переориентация боковых радикалов и переход полипептидной цепи в новую более компактную форму, причем число нековалентных связей значительно увеличивается. Характерной особенностью этой стадии является образование специфических контактов между атомами, находящимися на удаленных участках полипептидной цепи, но оказавшихся сближенными в результате образования тре­тичной структуры.

3. На последнем этапе формируется нативная конформация белковой молекулы, связанная с замыканием дисульфидных свя­зей и окончательной стабилизацией белковой конформации. Не исключена также неспецифическая агрегация частично свернутых полипептидных цепей, что можно квалифицировать как ошибки образо­вания нативных белкоя. Частично свернутая полипептидная цепь (этап 2) называется расплавленной глобулой, а этап 3 является самым медленным при образовании зрелого белка.

В клетках имеется ряд каталитически неактивных белков, которые, тем не менее, вносят большой вклад в образование пространственных структур белков. Это так называемые шапироны и шапиронины. Один из первооткрывателей молекулярных шапиронов Л. Эллис называет их функциональным классом не связанных друг с другом семейств белков, кото­рые помогают правильной нековалентной сборке других полипептидсодержащих структур in vivo, но не входят в состав собираемых структур и не участву­ют к реализации их нормальных физиологических функций.

Шапироны помогают правильной сборке трехмерной белковой конформации путем образования обратимых нековалентных комплексов с частично свернутой полипептидной цепью, одновременно ингибируя неправильно об­разованные связи, ведущие к формированию функционально неактивных бел­ковых структур. В перечень функций, свойственных шапиронам, входит заши­та расплавленных глобул от агрегации, а также перенос новосинтезированных белков в различные локусы клеток. Шапироны преимущественно являются белками теплового шока, синтез которых резко усиливается при стрессовом температурном воздействии. Семейства этих белков найдены в микробных, растительных и живот­ных клетках. Классификация шапиронов основана на их молекулярной массе, которая варьирует от 10 до 90 kDa. В основном функции шапиронов и шапиронинов различаются, хотя и те, и другие являются белками-помощниками процессов образования трехмерной структуры белков. Шапироны удерживают новосинтезированную полипептидную цепь в развернутом состоянии, не да­вая ей свернуться в отличную от нативной форму, а шапиронины обеспечивают условия для образования единственно правильной, нативной структуры белка.

Четвертичная структура белков

Образование хаотично сформированных агрегатов является ошибкой, ко­торая приводит к появлению функционально неактивных белков, поэтому в клетках предусмотрены механизмы быстрой их деградации и распада на от­дельные аминокислоты. Однако в природе существует немало генетически де­терминированных агрегатов, включающих в себя несколько полипептидных цепей, образующих большие белковые макромолекулы. Четвертичной струк­турой называют ассоциированные между собой две или более субъединиц, ориентированных в пространстве. По-видимому, более правильно примени­тельно к четвертичной структуре белков говорить не об агрегатах, а об ансамб­лях глобул. Характеризуя четвертичную структуру белков, следует исключать ее псевдоварианты. Так белковый гормон инсулин состоит из двух полипеп­тидных цепей, но они не являются полноправными глобулами, а образуются в результате ограниченного протеолиза единой полипептидной цепи. Не явля­ются белками с истинной четвертичной структурой и мультиферментные комплексы. Они представляют собой типичные надмолекулярные структуры. При образовании четвертичной структуры отдельные субъединицы взаимодействуют друг с другом исключительно при помощи нековалентных связей, в первую очередь водородных и гидрофобных. Весьма существенным является тот факт, что контактные поверхности взаимодействующих субъеди­ниц комплементарны друг другу. В контактных участках расположены гидро­фобные группировки, которые получили название «липкие пятна».

Взаимная ориентация электроотрицательных атомов, облегченная нали­чием комплементарных сайтов, способствует образованию большого числа во­дородных связей. Это обеспечивает реализацию кооперативного эффекта и стабилизацию макромолекулы. Кроме того, множественность нековалентных связей является основой передачи структурных перестроек от одной субъеди­ницы на другие.

Белки, имеющие четвертичную структуру, часто называют олигомерными. Различают гомомерные и гетеромерные белки. К гомомерным относятся белки, у которых все субъединицы имеют одинаковое строение. В качестве примера можно привести белок каталазу, состоящую из четырех абсолютно равноцен­ных субъединиц. У гетеромерных белков отдельные субъединицы не только отличаются по строению, но и могут выполнять различные функции. Напри­мер, белок РНК-полимераза состоит из пяти субъединиц различного строения и с неодинаковыми функциями.