Лабораторная работа 7. Свойства ферментов

Опыт 1. Количественное определение активности амилазы слюны в присутствии активатора и парализатора фермента

Метод основан на определении минимального «порогового» количества фермента, которое способно при определенных условиях опыта расщепить 1 мл 0,1%-ного раствора крахмала. Это минимальное количество фермента принимается за единицу амилазной активности. Амилазная активность слюны (А) выражается количеством миллилитров 0,1%-ного раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при температуре 38°C в течение 30 мин. Результаты работы по определению амилазной активности фиксируют в форме таблицы.

Ход выполнения опыта. Заготавливают 3 ряда из 6 одинаковых пронумерованных пробирок. В каждую пробирку наливают по 1 мл дистиллированной воды. В 1 пробирку первого ряда добавляют 1 мл слюны, разведенной 1:10 (для разведения слюны в 10 раз к 1 мл ее добавляют 9 мл дистиллированной воды). Содержимое первой пробирки перемешивают, а затем 1 мл переносят во вторую пробирку. Содержимое второй пробирки перемешивают тем же способом и 1 мл смеси переносят в третью пробирку и т.д. Из шестой пробирки 1 мл смеси выбрасывают. Таким же образом разводят слюни во втором и третьем рядах. В каждом ряду получают разведение фермента в 20, 40, 80 и более раз. Во все пробирки первого ряда добавляют по 1 мл дистиллированной воды, в пробирки второго ряда ^_ по 1 мл 0,1%-ного раствора хлористого натрия, в пробирки третьего ряда – по 1 мл 0,1%-ного раствора сульфата меди. Во все пробирки добавляют из бюретки по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала. Содержимое перемешивают и пробирки оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По истечении указанного времени пробирки доливают доверху водой, добавляют по 1 капле 1%-ного раствора йода и содержимое пробирок перемешивают. Жидкость в пробирках окрашивается в желтый, красный, синий цвета. Желтое окрашивание свидетельствует о полном расщеплении крахмала, красное – о расщеплении крахмала до декстринов. В каждом ряду отмечают наибольшее разведение слюны, при котором произошло полное расщепление крахмала, и рассчитывают амилазную активность

. Пример расчета.

Рассчитывают количество слюны в последней пробирке с желтоватой окраской. Если слюна в ней, например, была разведена в 160 раз, составляют следующую пропорцию:

1/160 слюны расщепила 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала

1 мл слюны расщепил Х мл 0,1%-ного раствора крахмала

По результатам опыта и расчетов студент должен сделать вывод о влиянии на амилазную активность хлорида натрия и сульфата меди.