Методы хранения культур обеспечивают

Длительное поддержание их жизнеспособности

Основные цели хранения культур — это поддержание жизнеспособности клеток и чистоты культуры, а также предотвращение изменений и мутаций, т. е. сохранение микроорганизма в максимально близком к исходному штамму состоянии. Для хранения важен правильный выбор среды и метода культивирования, а также возраста культуры на момент начала хранения.

Методы непродолжительного хранения лишь частично удовлетворяют этим критериям. Из таких методов чаще всего применяется периодический пересев культур на свежую среду с выращиванием при низкой температуре и последующим хранением в холодильнике. Культуры споровых бактерий, содержащие зрелые споры, можно хранить сухими в стерильной почве, на стерильной фильтровальной бумаге или в виде культур, высушенных при помощи силикагеля. Некоторые бактерии хорошо переносят хранение в высушенных каплях желатина. Для многих целей хранят клетки в жизнеспособном состоянии в течение лет при температуре —20 °С или, что лучше, при —70 °С (глубокое замораживание). Для хранения с помощью этих методов необходимо использовать культуры всередине или в конце экспоненциальной фазы роста, сконцентрированные и затем ресуспендированные в небольшом количестве свежей питательной среды. При замораживании в среде должны присутствовать криопротекторы, такие как глицерол (15-40 об. %) или диметилсульфоксид (ДМСО, 5-10 об. %), предохраняющие клетки от повреждения замораживанием, которое должно происходить со скоростью 1 °С/мин. Оттаивание замороженных культур рекомендуется производить в более быстром режиме.

В настоящее время широко применяются методы длительного хранения, основанные на лиофилизации или ультразамораживании культур в жидком азоте (—196 °С) либо над жидким азотом (—150 °С). Для оценки эффективности этих методов их сравнивают по доле выживших клеток после определенного времени хранения. Ожидаемый период выживания бактерий при обоих способах длительного хранения превышает 40 лет, в то время как при глубоком замораживании он составляет 1-3 года. При ультра-замораживании к суспензии обычно добавляют криопротекторы, такие как глицерол (10 об. %) или ДМСО (5 об. %). Эти соединения водорастворимы и способны легко проходить через клеточную мембрану, имеют низкую точку плавления и могут замещать воду в качестве гидратной оболочки, уменьшая таким образом повреждающее влияние дегидратации при замерзании воды. Поэтому замораживание и образование кристаллов льда в среде протекает замедленно. Происходящее при этом возрастание концентрации внеклеточного раствора приводит к тому, что вода начинает выходить из клеток. По мере замораживания вся свободная вода кристаллизуется (в виде чистого льда), оставляя концентрированный раствор, замерзание которого приводит к образованию лишь незначительного количества повреждающих клетку кристаллов.

 

Лиофилизация заключается в удалении воды из замороженных клеток путем сублимации при низком давлении; при этом вода испаряется без перехода в жидкую фазу. Лиофильно высушенные клетки сохраняют жизнеспособность в течение длительного времени, если защищены от действия кислорода, влаги, высокой температуры и света. При лиофилизации к суспензии часто добавляют криопротекторы, такие, например, как молочная сыворотка (20%, вес/объем), лошадиная сыворотка (10 об. %), сахароза (12%, вес/объем) или другие химические вещества.

Лиофилизация

(от греч. lýo — растворяю и philéo — люблю)

лиофильная сушка, высушивание тканей и др. биологических объектов в замороженном состоянии под вакуумом. При этом вода удаляется из замороженных объектов путём сублимации льда, т. е. превращения его в пар, минуя жидкую фазу. Метод Л. позволяет получать сухие ткани, препараты, продукты и т. п. без потери их структурной целостности и биологической активности. При Л. большинство белков не подвергается денатурации (См. Денатурация) и может длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0°С). Лиофилизированные ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства. Л. применяют при необходимости продолжительного хранения и консервирования различных продуктов биологического происхождения, для получения сухой плазмы донорской крови, сухих сывороток и вакцин, при трансплантации органов и тканей, в фармацевтической и пищевой промышленности. В системах жизнеобеспечения (См. Жизнеобеспечение) космического корабля Л. применяется как один из перспективных способов регенерации воды из влагосодержащих материалов.

 

Лит.: Применение замораживания — высушивания в биологии, пер. с англ., под ред. Р. Харриса, М., 1956.

 

Лиофилизация (от др.-греч. λύω — растворяю и φιλέω — люблю) — способ мягкой сушки веществ, при котором высушиваемый препарат замораживается, а потом помещается в вакуумную камеру, где и происходит возгонка растворителя.

Преимущества лиофилизации

Преимущества такого способа высушивания — отсутствие воздействия высоких температур на препарат, сохранение дисперсной фазы препарата, возможность использования летучих растворителей. Метод лиофилизации позволяет получать сухие ткани, препараты, продукты и т. п. без потери их структурной целостности и биологической активности. При лиофилизации большинство белков не подвергается денатурации и может длительно сохраняться при умеренном охлаждении (около 0 °C). Лиофилизированные ткани и препараты при увлажнении восстанавливают свои первоначальные свойства.

 Недостатки лиофилизации

Недостатками лиофилизации является необходимость тщательной подготовки препарата к сушке, создание высокого вакуума для полноты высыхания, длительность сушки и достаточно высокие энергозатраты.

Применение

Лиофилизацию применяют при необходимости продолжительного хранения и консервирования различных продуктов биологического происхождения, для получения сухой плазмы донорской крови, сухих сывороток и вакцин, при трансплантации органов и тканей, в фармацевтической и пищевой промышленности. В системах жизнеобеспечения космического корабля лиофилизация применяется как один из перспективных способов регенерации воды из влагосодержащих материалов.

 

1. Современная микробиология под редакцией Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля; Москва, 2005, - 288с.

2. Общая микробиология под редакцией Л. В. Алексеевой и Е. Н. Кондратьевой, - Москва 1987, - 566с.

 

 

       Физиологические основы криоконсервирования клеток

В процессе замораживания клеток необходимо выделить следующие методические этапы:

1. Приготовление клеточных суспензий (например, выделение необходимых клеток крови, сперматозоидов, яйцеклеток).

2. Подготовка клеточных суспензий к консервации (например, добавление криопротекторов).

3. Собственно замораживание.

4. Хранение криоконсервированных клеток в специальных емкостях при определенных температурах. По диапазонам температур выделяют следующие этапы криоконсервации клеток.

1. От -37 до -25 °С - зона температурного оптимума биологической активности.

2. От -25 до -10 °С - зона перехода клеток в состояние неполного анабиоза (временное прекращение или торможение метаболических процессов, «переохлаждение» клеточных суспензий без кристаллизации воды).

3. От -10 до -80 °С - зона кристаллизации охлажденной и переохлажденной окружающей клетку и внутриклеточной воды и перехода клетки в состояние полного анабиоза.

4. От -80 до -130 °С - зона кристаллизации связанной и адсорбированной воды и рекристаллизации.

5. От -130 до -273 °С - зона отсутствия кристаллизации и рекристаллизации.

Итак, суспензия клеток в изотоническом растворе солей (например, физиологическом) должна начать замерзать при -0,6 °С - температуре замерзания данного раствора. Однако замерзание суспензии обычно начинается с кристаллизации т.н. внеклеточной (расположенной между клетками) воды только при понижении температуры до -10 °С, при которой и происходит формирование «очагов» кристаллизации воды. При этом клеточная суспензия в диапазоне температур от 0 до -10 °С является переохлажденной, т.е. находящейся в метастабильном, жидком состоянии. Замерзание внутриклеточной жидкости обычно начинается при температуре около -40 °С.На этапах замораживания клеточных суспензий повреждение клеток могут вызвать следующие факторы:

1. Скорость замораживания. Следует отметить, что для каждого типа клеток существует своя, оптимальная скорость замораживания, которая определяется экспериментальным путем. Если суспензия клеток замораживается слишком быстро, то сначала образуются внутриклеточные кристаллы льда, которые разрывают клеточные органеллы и мембрану, приводя к лизису и гибели клеток после их размораживания. Наоборот, если клетки замораживать слишком медленно, сначала происходит замораживание внеклеточной воды, что приводит к образованию гиперконцентрированных растворов солей и изменению рН среды. Все это вызывает т.н. обезвоживание клеток и впоследствии их гибель.

2. Перегрев клеток при замораживании наблюдается в результате выделения тепла в момент фазового перехода жидкой внеклеточной воды в лед. Такой перегрев также может привести к необратимому повреждению клеток. Для его предотвращения в ряде случаев применяют программное, или контролируемое замораживание, когда в момент фазового перехода вода/лед суспензию клеток стараются кратковременно охлаждать очень быстро, что нейтрализует перегрев клеток.

3. Холодовой шок, о котором упоминалось выше.

Криопротекторы

 

Несмотря на перечисленные выше проблемы, в настоящее время удается заморозить и затем разморозить суспензии клеток, сохранив при этом их жизнеспособность. Этого можно добиться благодаря одновременному использованию двух подходов:

1. Применение т.н. криопротекторов - веществ, которые обладают способностью предупреждать развитие криоповреждений и обеспечивать сохранность клеток в жизнеспособном состоянии после замораживания и размораживания.

2. Охлаждение с определенной, оптимальной для данного типа клеток скоростью.

Криопротекторы разделяют на быстро проникающие в клетку низкомолекулярные вещества (диметилсульфоксид), медленно проникающие (глицерин) и непроникающие высокомолекулярные вещества (полиэтиленоксид). Общим механизмом действия криопротекторов является их способность связывать молекулы воды, что замедляет рост кристаллов льда. Это предупреждает быстрое нарастание концентрации солей во внеклеточной среде и повреждение клеток в результате осмотического шока.

Методы замораживания клеток и их хранение

Применяют два основных метода замораживания:

1. Неконтролируемое, или ручное замораживание, когда сосуд с суспензией клеток в смеси с криопротектором помещают в морозильную камеру (-80 °С) или в пары жидкого азота (-130°С) - замораживание происходит со скоростью примерно 1-3 °С в мин;

2. Контролируемое, или программное замораживание, при котором клеточные суспензии охлаждают с помощью специальных приборов - программных замораживателей.

Такой способ позволяет достичь наилучших результатов. Замороженные клетки хранят в электрических морозильных камерах при температуре от -80 до -130 °С или в сосудах Дьюара: жидким азотом при температуре -196 °С. Чем ниже температура в хранилище, тем дольше можно сохранить жизнеспособные клетки. Хотя при температуре ниже -150 °С существенной разницы уже не наблюдается, так как метаболические и кристаллизационные процессы в клетках не происходят.

Размораживание клеток

Необходимо для восстановления функциональной активности клеток после хранения. В физическом смысле под размораживанием понимают повышение температуры биологических объектов, сопровождающееся фазовым переходом льда в жидкое состояние. На этом этапе клетки могут быть необратимо повреждены в результате двух процессов:

1. Рекристаллизации льда - образования больших кристаллов из мелких и повреждения последними клеточных структур.

2. Гипотонического шока - резкого снижения осмолярности внеклеточной жидкости в результате быстрого плавления внеклеточного льда.

Для предотвращения этих феноменов на практике применяют несколько методов размораживания:

1. Нагрев теплопередачей - путем быстрого погружения сосудов с замороженными клетками в воду температурой около +40 °С.

2. Нагрев в сверхвысокочастотном (СВЧ) электромагнитном поле.

3. Размораживание теплопередачей с воздействием давления. В клинической медицине, как правило, ограничиваются наиболее простым способом - размораживанием в водяной бане.

 

Однако существенным моментом является предотвращение токсического действия криопротекторов после размораживания (особенно токсичен для клеток диметилсульфоксид). Для этого обычно применяют два способа:

1. Размороженные клетки отмывают от криопротекторов in vitro путем постепенного добавления изотонического раствора, содержащего 10-20% сыворотки или альбумина, что смягчает эффекты изменения осмотического давления.

2. Свежеразмороженную клеточную суспензию быстро вводят внутривенно пациенту вместе с криопротектором, при этом плазма крови нейтрализует осмотическое и токсическое повреждение размороженных клеток (например, при трансплантации размороженного костного мозга). Важным моментом является контроль жизнеспособности замороженных и размороженных клеток.

С этой целью используют два основных подхода:

1. Морфологическая оценка жизнеспособности, например, по исключению красителя трипанового синего (не проникает через неповрежденную мембрану и не окрашивает клетки).

2. Исследование функциональной активности размороженных клеток (выбор теста зависит от их типа - в случае кроветворных клеток это может быть изучение способности образования ими колоний в агаре под действием колониестимулирующих факторов; в случае сперматозоидов - оценка их подвижности и т.п.).

Криоконсервирование кроветворных клеток

Трансплантацию кроветворных клеток человека используют для восстановления гемопоэза у больных после воздействия цитостатических противоопухолевых препаратов или тотального облучения тела. У таких пациентов наблюдается полное исчезновение собственных клеток крови, и без пересадки кроветворных клеток они умирают от инфекций. Забор костного мозга или периферических стволовых клеток крови производят до начала интенсивной химиотерапии или облучения (курс продолжается до 1-й недели или более), а затем клетки переливают (трансплантируют) для восстановления гемопоэза. Для лечения некоторых заболеваний используют также аллогенные кроветворные клетки от HLA-совместимого здорового донора. Однако до трансплантации гемопоэтические клетки необходимо сохранять в жизнеспособном состоянии. Это можно сделать путем их замораживания с последующим размораживанием. В настоящее время для восстановления кроветворения используют клетки костного мозга, стволовые клетки периферической крови, клетки крови пупочного канатика новорожденных; разрабатываются подходы к трансплантации клеток эмбриональной печени.

Все типы кроветворных клеток могут быть подвергнуты криоконсервированию с последующим успешным размораживанием и восстановлением функциональной активности. Как правило, замораживают суспензию клеток в аутологичной плазме или сыворотке в присутствии криопротектора (обычно используют 10%-й диметилсульфоксид). Замороженные таким образом кроветворные клетки сохраняют жизнеспособность после хранения в течение 1-го года и более. Перед трансплантацией клетки быстро размораживают, и вводят суспензию внутривенно без отмывки от криопротектора.

Криоконсервирование зрелых клеток крови

Криоконсервирование эритро-, лейко-, тромбоцитов в последнее время применяется все реже. Это связано с большей терапевтической эффективностью свежевыделенных клеток (особенно тромбоцитов), сужением показаний к переливанию лейкоцитов в целом, а также с внедрением автоматических сепараторов клеток крови, которые позволяют получать большое количество свежих донорских клеток в необходимое время.

Однако на данном примере можно отметить различие в подходах к криоконсервации тех или иных типов клеток. Так, для эритроцитов в отличие от кроветворных клеток наиболее подходящими криопротекторами являются глицерин или полиэтиленоксид.

При этом оптимальная скорость замораживания эритроцитов составляет примерно 1000 °С в мин. Поэтому эритроциты помещают в т. н. замораживающий или ограждающий раствор с 30%-м глицерином и после инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин для полной «глицеринизации» (проникновения криопротектора в клетки) погружают в специальных контейнерах непосредственно в жидкий азот. Такой подход неприемлем для замораживания ядросодержащих лейкоцитов или тромбоцитов, которые требуют постепенного, медленного охлаждения. В целом методики замораживания этих клеток сходны с технологией криоконсервации кроветворных клеток.

Криоконсервирование половых клеток

Относительно новым и весьма актуальным направлением в репродуктивной медицине является криоконсервирование сперматозоидов и яйцеклеток человека. Замораживание сперматозоидов уже практически стало рутинной процедурой в ряде зарубежных центров. Созданы специальные «банки» половых клеток, которые содержат материал, применяемый для искусственного оплодотворения. Важным аспектом является криоконсервирование спермы онкологических больных. Это дает им шанс иметь нормальное потомство после курса химиотерапии или облучения, в результате которых пациенты часто становятся бесплодными. Замораживание сперматозоидов производят с использованием режима, сходного с криоконсервацией кроветворных клеток. Однако в качестве криопротектора обычно применяют специфическую смесь на основе глицерина и желтка куриных яиц.

Что касается замораживания яйцеклеток, то эта процедура, практически вполне осуществимая, пока не вошла в обычную клиническую практику и находится на стадии разработки. Однако особенно перспективным представляется успешное замораживание и размораживание жизнеспособных эмбрионов человека (полученных, правда, на очень ранней стадии).

Заключение

В настоящее время проводятся экспериментальные испытания по трансплантации замороженных и размороженных живых тканей, таких как эндокринные железы, легочная ткань, ткани сердечной мышцы и др. В ряде центров интенсивно разрабатываются новые криопротекторы, которые в отличие от существующих не обладали бы токсическим действием на клетки. Теоретическая возможность создания таких веществ, а также постоянное совершенствование технологии замораживания позволяют надеяться, что в недалеком будущем медицина вплотную подойдет к решению проблемы криоконсервации отдельных органов.

Криоконсервирование клеток человека. Усс А.Л., Мицкевич П.Б., Завгородняя И.Л. Республиканский центр гематологии и трансплантации костного мозга на базе 9-й клинической больницы г. Минска. Опубликована в журнале «Медицинская панорама» №2(27)2003,стр.38

 

При использовании проникающих криопротекторов эритроциты после размораживания необходимо отмывать. Согласно стандартным методикам для эритроцитов человека [3] проводилась троекратная отмывка. Криопротектор удаляли из эритроцитов методом последовательного центрифугирования.

 

1. Денисова О.М. Кріочутливість еритроцитів різних видів ссавців: Автореф. дис…канд.біол.наук - Харків, 2006,- 20 с.

2. Гаврилов О.К., Аграненко В.А. Методы долгосрочного хранения в замороженном состоянии эритроцитов, предназначенных для трансфузии: Метод. рекомендации.- М.: Медицина, 1980.-35 с.

3. Цуцаева А.А., Аграненко В.А. Криоконсервирование клеточных суспензий. - Киев: Наук.думка, 1983. – 240 с.