Определение гена метаболизма кофеина методом ПЦР

Многие биологически активные вещества в организме человека подвергаются окислению в клетках печени ферментами семейства цитохромов Р450. Цитохромы Р450 обнаружены у всех живых организмов. У человека белки этого семейства принимают участие в метаболизме лекарств (например, парацетамола, эритромицина), стероидов, витамина Д, холестерина и других соединений. Одним из наиболее хорошо изученных представителей данного семейства является цитохром Р450 1А2 (CYP1A2), на долю этой формы фермента приходится до 13% ферментов печени. CYP1A2 принимает участие в метаболизме ксенобиотиков (чужеродных соединений), его субстратами среди прочих, являются многие антидепрессанты, кофеин, парацетамол. Интересно, что индукторами этого фермента являются вещества, содержащиеся в табаке, брокколи, цветной капусте.

Известно, что ген CYP1A2 находится в 15 хромосоме человека и связан с регуляцией артериального давления. Показано, что аллель rs762551 данного гена связана с пониженной активностью фермента. У носителей аллеля С гена (около 50% населения) кофеин метаболизируется в 4 раза медленнее, чем у носителей аллеля А. По этой причине «лишняя» чашка кофе значительно повышает риск возникновения инфаркта миокарда у носителей аллеля С, в то время как количество выпитого кофе у носителей аллеля А миокарда не ассоциируется с данным заболеванием. Более того, прием до 3 чашек кофе в день у носителя аллеля А вызывает благоприятный эффект на сердечно-сосудистую систему. Носителям аллелей АА кофе пить можно, носителям АС можно пить кофе в умеренном количестве, носителям СС следует отказаться от кофе.

Для анализа полиморфизма по данному участку подбирают праймеры к двум разным вариантам гена и проводят ПЦР с данными праймерами в отдельных пробирках. После проведения полимеразной цепной реакции проводят электрофорез в агарозном геле, далее детектируют результат с помощью трансиллюминатора. В случае, если человек имеет генотип АА, продукт будет нарабатываться только в одной из пробирок (а именно с праймерами к полиморфизму А), аналогично в случае генотипа СС. Если же человек является гетерозиготным по данному гену и несет как аллель А, так и аллель С, то продуктыПЦР будут нарабатываться в двух пробирках.

Интерпретация результатов

Пример гель-электрофореза продуктов амплификации аллеляrs762551 приведен на рисунке. Пациент 1 имеет генотип АА, так как продукт амплификации наблюдаем только в первой пробирке, генотип пациента 2 – СС, так как продукт заметен только в второй пробирке, пациент 3 гетерозиготен, так как продукты амплификации наработаны в двух пробирках.

Электрофоретический анализ продуктов ПЦР в агарозном геле. Генотип образца 1 (АC), генотип образца 2 (СС), генотип образца 3 (AA).

Дополнительные вопросы

1. Для чего в полимеразной цепной реакции необходимы два праймера?

2. Какую роль играют нуклеозидтрифосфаты и MgCl₂в реакционной смеси?

3. Какие результаты ПЦР можно ожидать, если на первой стадии будет отобрано слишком малое количество клеток эпителия ротовой полости?

4. Почему полиморфизм по аллелюrs762551 оказывает влияние на метаболизм кофеина?

5. Какое диагностическое значение может иметь информация о полиморфизме гена CYP1A2?