Изложите принцип метода гель-электрофореза нуклеиновых кислот; опишите состав буфера и геля для гель-электрофореза, способы оценки результатов

Электрофорез ДНК в агарозном геле — аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по длине. Основан на разной скорости движения фрагментов разной длины при движении в геле под действием внешнего электрического поля.

При проведении электрофореза фрагменты ДНК мигрируют в геле под воздействием сил электрического поля. Дело в том, что сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.

Электрофорез в агарозном геле используют для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК, а также для определения качества интактной плазмиды (не обработанной ферментами). ДНК в геле окрашивают интеркалирующим (чаще всего) или флуоресцирующим красителем. В ультрафиолетовом свете в агарозном геле можно заметить даже 1 нг ДНК.

Скорость миграции ДНК при электрофорезе определяется шестью параметрами:

– размером молекулы ДНК;

– концентрацией геля;

– конформацией молекулы ДНК;

– напряженностью электрического поля;

– составом оснований ДНК;

– температурой геля при проведении электрофореза.

Электрофорез ДНК проводят в трис-боратном (ТВЕ) или трисацетатном (ТАЕ) буфере. Исторически сложилось так, что агарозный электрофорез чаще проводят в ТАЕ.

Окрашивание ДНК в геле. Удобнее всего для окрашивания ДНК в агарозном геле использовать флуоресцирующий интеркалирующий краситель бромистый этидий. Молекула этого вещества содержит плоскую группу, которая интеркалирует между соседними основаниями ДНК. В результате УФ-излучение, поглощаемое ДНК, передается на краситель и испускается затем в красно-оранжевой области видимого спектра (590 нм).

Электрофорез проводили в буфере ТАЕ

Для приготовления 1 л 50× ТАЕ (Трис-Ацетат-ЭДТА) потребуется:

– 242 г трис-основной (категорически не трис-HCl!!!);

– 57,1 мл ледяной уксусной кислоты;

– 100 мл 0,5 М ЭДТА;

– дистиллированная вода – до 1 л, рН довести до 8,5.

Для приготовления геля использовать тот же буфер, в котором будет проводиться электрофорез, лучше взятый из одной колбы и одного разведения, так как в геле и буфере должны быть идентичные ионы одинаковой концентрации. Для приготовления 50 мл 1,5%-ного агарозного геля понадобится:

– 1,5 г агарозы;

– 1 мл 50× ТАЕ (у нас 10 мл 5× ТАЕ)

– дистиллированная вода до 50 мл.

Полученную смесь с агарозой плавить в микроволновой печи или на плитке до полного растворения и получения прозрачного раствора. К охлажденной до 50–55°С агарозе добавить бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл (на 100 мл р-ра агарозы 10 мкл концентрированного раствора бромистого этидия 5 мкг/мкл).

Как бы на вопрос ответили, можете написать в принципе ход. Я оч кратко:

-В электрофоретическую кювету залить раствор агарозы слоем 5–7 мм и сразу же вставить гребенку. Застывание геля 20–40 мин.

-Поместить гель в электрофоретическую камеру. Заполнить ТАЕ буфером, чтобы покрыть гель на 3–5 мм.

-Аккуратно вынуть гребенку.

-Приготовить и нанести раствор со стандартным маркером мол. массы ДНК в лунку геля.

-Приготовить анализируемые образцы ДНК для нанесения. К 2 мкл красителя добавить 2 мкл ПЦР продукта. Перемешать и тут же нанести в лунку геля

-Провести электрофорез при 6 В/см на расстояние, необходимое для определения молекулярной массы фрагмента

-Аккуратно извлечь гель из камеры, перенести в трансиллюминатор и сфотографировать

-Определить размеры амплифицированных фрагментов путем сравнения с размерами маркерных фрагментов ДНК. Конецъ.

59. Опишите этапы лабораторной работы по агробактериальной трансформации листьев табака Nicotiana benthamiana с указанием состава питательных сред на каждом этапе.

Трансформация методом листовых дисков заключается в совместном культивировании эксплантов листьев табака и ночной культуры Agrobacterium tumefaciens, во время которого происходит перенос Т-ДНК Ti-плазмиды агробактерии в геном растения с последующей регенерацией трансформантов на селективной среде. Состав сред для культивирования тканей табака в условиях in vitro представлен в табл. 1 и 2. Процесс получения трансформантов состоит из нескольких этапов.

1-й этап. Совместное культивирование листовых дисков и агробактерий. В качестве эксплантов используют листья, полученные от стерильных растений табака 5–6-недельного возраста, выращенных на агаризованной безгормональной среде Мурасиге – Скуга. В условиях ламинарбокса в стерильной чашке Петри удалить срединную жилку листа, нарезать лист на фрагменты около 1 см², острым скальпелем нанести поранения.

Состав агаризованной питательной среды Мурасиге – Скуга, мг/л

Компонент среды	мг/л
KNO₃	1 900
KH₂PO₄	170
NH₄NO₃	1 650
MgSO₄ × 7H₂O	370
CaCl₂ × 2H₂O	440
FeSO₄ × 7H₂O	37,3
Na₂EDTA × 2H₂O	27,8
KI	0,83
H₃BO₃	6,2
MnSO₄ × 4H₂O	22,3
CoCl₂ × 6H₂O	0,025
CuSO₄ × 5H₂O	0,025
ZnSO₄ × 7H₂O	8,6
Na₂MoO₄ × 2H₂O	0,25
Тиамин HCl	1
Пиридоксин HCl	0,5
Никотиновая кислота	0,5
Сахароза	30 000
Агар	9 000
Дистиллированная вода	До литра
рН	5,8

Подготовленные экспланты аккуратно разложить нижней стороной вверх в чашки Петри на поверхность жидкой среды Т0, предварительно добавив в чашки 2–3 капли ночной культуры А. tumefaciens. Чашки Петри оставить на 2 сут в затенённом месте.

2-й этап. Отмывание эксплантов. Стерильным носиком отобрать среду из чашки Петри, добавить стерильную дистиллированную воду и листовые диски осторожно перенести в другую чашку Петри со стерильной водой. Экспланты промыть пять раз и перенести в чашки Петри на жидкую среду Т1 с добавлением 20 г/л сахарозы, 500 мг/л цефотаксима для подавления роста А. tumefaciens. Чашки оставить на 2 сут в затенённом месте.

3-й этап. Регенерация трансформантов на селективной среде. Экспланты промокнуть на стерильной фильт. бумаге и перенести в чашки Петри с агаризованной средой Т2.

По мере образования каллуса экспланты перенести в пробирки со средой Т3, которая стимулирует побегообразование. Зелёные побеги перенести для укоренения в пробирки со средой Т4.

Состав сред для трансформации табака и получения растений-трансформантов

Компонент среды	Среда Т0 Кокультивация	Среда Т1 Отмывка от агробактерии	Среда Т2 Индукция канамицин- устойчивого каллуса	Среда Т3 Индукция побегообразования	Среда Т4 Укоренение растений- регенерантов
Среда MС	1×	1×	1×	1×	1×
Сахароза	20 г/л	20 г/л	20 г/л	20 г/л	20 г/л
Агар	–	–	7 г/л	7 г/л	7 г/л
БАП	–	–	1 мг/л	0,1 мг/л	–
НУК	–	–	0,1 мг/л	–	–
Цефатоксим	–	500 мг/л	500мг/л	500мг/л	500мг/л
Канамицин	–	–	100 мг/л	100 мг/л	100 мг/л