Опишите ход лабораторной работы по трансформации компетентных клеток E.coli рекомбинантной плазмидой, несущей маркерный селективный ген и ген интереса

Трансформация - то перенос вектора в клетки специального штамма E. coli Трансформация состоит из двух частей это получение компетентных клеток с ночного высева бактерий с суспензионную среду и непосредственно трансформация. Между этими двумя этапами часто используют недлительную заморозку в жидком азоте или холодильнике на -80, что улучшает производительность.

Получение компетентных клеток проходит в несколько этапов:

-Отдельную бактериальную колонию засеять в 5 мл среды LB (10 г/л бакто-триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl довести 5 М NaOH до pH = 7,4, автоклавировать при 1,2 атм (127°С в течение 1 ч) 14– 16 ч в термостатированной качалке 180 об./мин при температуре 37°С.

-Утром 500 мкл этой культуры засеять в 50 мл LB и подрастить до определенной опт.плот.

-Перенести в центрифужные пробирки, охладить во льду в течение 30 мин. Центрифугировать клетки при 4°С 3 000 об./мин в течение 5 мин.

-Супернатант тщательно удалить, а осадок аккуратно ресуспендировать в 15 мл буфера RF-1. Инкубировать во льду 15 мин и центрифугировать клетки при 4°С и 3 000 об./мин в течение 5 мин. Супернатант тщательно удалить. Осадок очень мягко ресуспендировать в 3 мл буфера RF-2 и инкубировать во льду 15 мин.

-Клетки расфасовать в охлажденные эпиндорфы по 100 мкл и сразу поместить в низкотемпературный холодильник на –70°С. 

Непосредственно трансформация осуществляется действием на клетки теплового шока, после добавления раствора плазмиды, смесь охлаждают до +4 градусов, а затем на 2 минуты помещают на водяную баню на +42 градуса.

Ход:

В реакцию трансформации взять 100 мкл компетентных клеток, которые предварительно оттаить во льду. К клеткам добавить 10 мкл охлажденной лигазной смеси (у нас готовая плазмидка), осторожно перемешать и поставить в лед на 30 мин.

Затем клетки подвергнуть тепловому шоку при температуре 42оС в течение 2 мин и охладить во льду в течение 10 мин. В это время клетка «захватывает» плазмиды

Клетки засеять на чашки Петри с агаризованной средой LB с необходимым количеством селективных маркеров (антибиотик был) и инкубировать в термостате при 37°С в течение 16 ч.

 

Объясните, как проводится отбор трансформированных клеток E.coli; какими методами проводится подтверждение наличия вставки гена интереса в отобранных предположительно трансформированных колониях.

Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Отбор клонов осуществляется реакцией ПЦР на исследуемые вставки. Детекция амплифицированного ПЦР-продукта осуществляется так же с помощью электрофореза

 

Изложите принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР); укажите состав компонентов реакционной смеси «Мастер микс» для ПЦР, температурный режим реакции ПЦР, проведенной на лабораторных занятиях. 

Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).

Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям.

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают праймеры (затравки) - синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами

Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:

-Выделенную ДНК из исследуемого образца,

-Буферный раствор,

-Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),

-Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.

-Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов.

-Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermus aquaticus).

Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов:

Денатурация (94оС, 3 минуты) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.

Отжиг праймеров (55оС,30 сек.) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.

Элонгация (72оС, 2-3 мин.) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

У нас был еще Последний цикл - 22оС, 2 мин – синтез второй цепи ДНК

Детекция результатов отличается в различных вариантах постановки ПЦР

ПЦР Мастер Микс включает:

- Taq ДНК-полимеразу (0,05 U / мкл),

- реакционный буфер,

- 4 мМ MgCl2 и

- 0,4 мМ каждого dNTP(дезоксинуклеотид-5-трифостфаты)

-20 х 1,25 мл воды, свободной от нуклеазы (эт на 1000 реакций)

Для постановки реакции ПЦР в мастер-микс требуется добавить только олигонуклеотиды, образец ДНК и воду.