2020-01-14
96
Компетентная клетка -Бактерия, находящаяся в таком физиологическом состоянии, когда она может воспринимать экзогенные молекулы ДНК, т.е. быть рецепиентом ДНК при трансформации; К.к. широко используются в генной инженерии в качестве рецепиентов векторных плазмид.
У многих видов бактерий компетентность возникает лишь на определенном этапе роста культуры. Например, культуры стафилококков находятся в стадии компетентности в ранней логарифмической фазе роста. Культуры бактерий Bacillus subtilis находятся в стадии компетентности на более поздних этапах экспоненциального роста, гемофильные бактерии – в стационарной фазе роста.
Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются
• обладают сниженным уровнем метаболизма;
• более устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции;
• сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием;
• меньшими размерами, чем некомпетентные;
• изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны;
• повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой обработке;
• сниженным поверхностным зарядом.
Однако существует много видов бактерий, у которых отсутствует естественная компетентность. Примером таких бактерий являются E. coli, бактерии рода Erwinia и другие, но несмотря на это, они также могут быть трансформированы.
Для этого их клетки обрабатывают тем или иным способом, индуцируя у них способность к поглощению ДНК. Наибольшую известность приобрел метод индукции компетентности с помощью ионов кальция – кальциевый метод. Клетки бактерий выдерживают в присутствии ионов Са2+ (50 мМ) при 0.С с последующим кратковременным тепловым воздействием при 37.С или 42.С. В этих условиях возникает общее состояние компетентности и появляется возможность осуществления хромосомной и плазмидной трансформации.
Эффективность трансформации повышается при совместном действии ионов Са2+ с ионами Mg2+, Mn2+ или Rb+. Кроме того, эффективность трансформации повышается при увеличении времени инкубирования с ионами Ca2+, а также при добавлении диметилсульфоксида. (это в 55 в. есть, в составе РФ среды и Са, и Мн и всё на свете)
Широко используется также способ индукции компетентности за счет глубокого замораживания с последующим оттаиванием клеток. При этом осуществляется трансформация как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Такой способ трансформации получил название криотрансформации. Чтобы получить трансформанты с помощью этого метода, смесь реципиентных клеток и ДНК донора в присутствии криопротектора (0,5 % раствора твина-80) замораживают (до –196.С), а затем отогревают при +42.С и высевают на селективные среды, позволяющие отобрать трансформанты.
