Микрофлора рыбы и рыбопродуктов

Цель занятия:

Провести санитарно-микробиологическое исследование свежей рыбы и сделать заключение о ее качестве.

Содержание занятия:

 

1. Определить бактериальную обсемененность в 1 г свежей рыбы.
2. Определить бактерии группы кишечных палочек в исследуемом объеме.
3. Определить наличие коагулазоположительного стафилококка в 1 г исследуемого материала.
4. Определить наличие сальмонелл в 25 г исследуемого материала.
5. Провести учет санитарно-микробиологических исследований свежей рыбы. Результаты записать в тетрадь.

 

Методические указания. Рыба и продукция, изготавливаемая из нее и нерыбных продук­тов промысла (за исключением консервированных), относятся к числу скоропортящихся. Изменения рыбы-сырца делятся на авто­литические, происходящие под действием ферментов тканей рыбы, и бактериальные, протекающие под действием микроорганизмов. Мясо рыбы по химическому составу близко к мясу теплокровных животных, но отличается меньшей стойкостью при хранении, что обусловлено разными причинами. Некоторые виды рыб сохраняют­ся неразделенными, в целом виде, а в кишечнике и жабрах всегда на­ходится много микроорганизмов. После вылова жабры у рыб пере­полняются кровью, в которой немало питательных веществ для бактерий. Слизь, покрывающая поверхность рыбы, не только содержит множество микроорганизмов, но и является благоприятной средой для их размножения.

Мясо рыб имеет более рыхлую консистенцию, чем мясо тепло­кровных животных, так как в их мышцах меньше соединительной ткани, а это способствует распространению микроорганизмов в теле рыбы. Количество и состав поверхностной микрофлоры только что выловленной рыбы могут значительно колебаться в зависимости от породы и вида рыбы, характера водоема, сезона, района и техники ло­ва. На 1 см² поверхности обнаруживается обычно 10²-10⁴ бактерий, а иногда и больше. В основном это водные микроорганизмы. Среди них преобладают аэробные бесспоровые грамотрицательные палоч­ковидные бактерии родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Flavobacterium. Встречаются микрококки и коринеформные бактерии, ре­же - спорообразующие бактерии, дрожжи и актиномицеты.

На рыбе, выловленной из загрязненных водоемов, могут находить­ся кишечная палочка, протей, а в отдельных случаях – сальмонеллы, цитробактеры и энтерококки. Наиболее обсеменены микроорганизмами жабры и кишечник. В 1 г содержимого кишечника свежеуснувшей рыбы насчитывается 10⁵-10⁸ клеток. Это различные гнилостные бактерии, среди которых немало спорообразующих анаэробов (С. sporogenes, С. putrificum). Обнаруживают и возбудителей пищевых отравле­ний - С. perfringens, Васillus cereus, Stafylococcus aureus и даже палоч­ки ботулизма (особенно в кишечнике осетровых рыб). На морской рыбе некоторых районов промысла встречается галофильный виб­рион (Vibrio parahaemolyticus) - возбудитель пищевых отравлений по типу токсикоинфекций.

Для более длительного сохранения рыбу замораживают или под­вергают другим способам консервирования: посолу, копчению, ма­ринованию, вялению.

При замораживании многие микроорганизмы, содержащиеся на рыбе, погибают, но некоторые выживают. Одни из них в процессе последующего хранения постепенно отмирают, другие долго оста­ются жизнеспособными, при этом микробов сохраняется тем боль­ше, чем ниже температура хранения.

На замороженной рыбе обнаруживают преимущественно раз­личные микрококки; палочковидные спорообразующие и не образу­ющие спор бактерии, в небольших количествах встречаются споры плесеней.

Посол - один из старинных способов сохранения рыбы. Консервирующее действие посола обусловлено высокой осмотической активностью раствора соли и снижением водной активности (Аw) среды. Посолу подвергают главным образом те виды рыб, которые способны при выдержке в определенных условиях созревать (сель­девые, лососевые), т. е. приобретать специфические вкусовые каче­ства и более мягкую консистенцию в результате биохимических про­цессов превращения белков и липидов под влиянием собственных ферментов рыбы. Созревшая рыба становится съедобной без допол­нительной кулинарной обработки. Некоторая роль в процессах со­зревания принадлежит и микроорганизмам, находящимся в тузлуке и на рыбе.

Типичные для свежей рыбы психрофильные виды Pseudomonas постепенно отмирают. Преобладающими в соленой рыбе становятся галофильные и солеустойчивые микрококки; в меньшем количестве обнаруживаются спороносные палочки; встречаются молочнокис­лые бактерии, дрожжи, споры плесеней, коринебактерии.

В соленой рыбе могут выживать и токсигенные бактерии: саль­монеллы, клостридий и стафилококке С. botulinum в первые дни за­сола продуцирует токсин в течение всего времени, пока концентра­ция соли достигнет необходимого уровня, достаточного для задерж­ки этого процесса.

В маринованной рыбе основным фактором, тормозящим разви­тие бактерий, в том числе гнилостных, является кислая среда (из-за наличия уксусной кислоты). Некоторое консервирующее действие оказывают добавляемые в маринад соль, сахар, а также пряности, содержащие эфирные масла и обладающие фитонцидными свойст­вами. Однако нередко пряности бывают также значительно обсеме­нены микроорганизмами.

Высушивание и вяление рыбы издавна используются для ее со­хранения как пищевого продукта. При удалении из рыбы воды до определенного предела создаются неблагоприятные условия для развития микробов. Консервирующее действие в вяленой и солено-сушеной рыбе оказывает также соль.

Консервирующим началом в копченой рыбе являются главным образом антисептические вещества дыма (или коптильной жидкости). Кроме воздействия антисептиков при горячем способе копче­ния на микрофлору рыбы губительно действует высокая температу­ра, а при холодном - наличие соли и подсушивание рыбы.

Качество хранения рыбной продукции в большой степени также зависит от санитарно-гигиенического состояния производства. Его периодически оценивают путем проведения микробиологического контроля инвентаря, оборудования, воздуха производственных помещений, тары, рук и санитарной одежды рабочих, соприкасаю­щихся с готовым продуктом. Критериями служат общая бактериаль­ная обсемененность и содержание бактерий группы кишечной па­лочки.

Отбор проб для исследования осуществляется по общим прави­лам (ГОСТ 26668-85). Сроки доставки образцов в лабораторию дол­жны быть минимальными, а в жаркое время года продукты необхо­димо охлаждать.

В лаборатории навеску рыбы и рыбопродуктов плотной конси­стенции стерильно растирают в ступке, добавляя стерильную водо­проводную или дистиллированную воду до конечной 10 %-ной кон­центрации взвеси.

Санитарно-микробиологическое исследование рыбы включает определение:

• бактериальной обсемененности в 1 г;

• бактерий группы кишечных палочек в определенном объеме;

• коагулазоположительного стафилококка в; 1 г;

• сальмонелл в 25 г.

 

Задание 1. Определение общей микробной обсемененности рыбы

Материалы и оборудование. свежая рыба, ступки с пестиками – стерильные; колба с физраствором; стерильные чашки Петри, пробирки со стерильной водой по 9 мл, пипетки на 1-2 мл, резиновые груши, спиртовки, спиртовые тампоны.

Существуют два метода определения ОМЧ:

• оптический метод прямого подсчета бактерий в специальных камерах (метод Горяева) в микроскопе, не позволяющий отли­чить живые бактерии от мертвых;

• бактериологический метод, позволяющий выявить определен­ную физиологическую группу бактерий, растущих при данных условиях. Бактериологический метод отличается меньшей точ­ностью.

 

Общее микробное об­семенение пищевого продукта определяется путем высева из 10-кратных разведений продукта на мясопептонный агар, последующего подращивания при температуре 37 °С и перерасчета по выросшим колониям количества мезофильных микробов - аэробов и факультативных анаэробов на 1 г продукта. Ход определения сводится к приготовлению разведении пробы продукта в соотношении 1:10,1:100, 1:1000 и высеву по 1 мл из каждого разведения в чашки Петри, которые заливают 10 мл расплавленного и охлажденного (до 45°С) мясопептонного агара. Посевы инкубируют 48 ч при температуре 37°С.

Таблица 11

Определение общей микробной обсемененности рыбы

(количество бактерий в 1 г)

Ингредиенты	Номера пробирок
	1	2	3
Засеваемые объемы, мл	1	1(1:100)	1(1:100)
Мясопептонный агар, мл	15	15	15
Результат
Заключение

 

 

Задание 2. Определение сальмонелл в рыбе и рыбных продуктах.

 

Материалы и оборудование. свежая рыба, ступки с пестиками – стерильные; колба с физраствором; среды: Эндо и висмут-сульфит агар в чашках Петри, пипетки на 1-2 мл, резиновые груши, спиртовки, спиртовые тампоны.

Обнаружение сальмонелл в рыбе и рыбных продуктах прово­диться из объема 25 г, взятого из нескольких кусочков внутренней и наружной проб (части) полуфабриката или готового кулинарного изделия. Пробу из­мельчают с помощью гомогенизатора или в стерильной фарфоровой ступке с 2-3 г стерильного песка, приливая 225 мл стерильного изотонического рас­твора хлорида натрия: в 1 мл исследуемой взвеси содержится 0.1 г продукта. 10 мл исследуемой взвеси вносят в колбу с 40 мл обогатительной среды. Одновременно высевают по 0,1 мл на среду Эндо и висмут-сульфитный агар. Посевы инкубируют при 37°С 18-24 ч.

Сальмонеллы образуют на висмут-сульфитном агаре круглые черные ко­лонии с сероватым металлическим ободком или зеленые колонии (с потемнением среды под колонией). Подозрительные колонии (в количестве 4 и 5) пересевают на среду Росселя или трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому, далее исследование проводят по обычной схеме: посев на пестрый ряд, определение подвижности, агглютинация с поливалентной и монорецепторными сальмонеллезными сыворотками, фаготипирование.

 

Задание 3. Определение бактерий группы кишечных палочек.

Материалы и оборудование. свежая рыба, ступки с пестиками – стерильные; колба с физраствором; пробирки с МПА и Кесслера, Эндо в чашках Петри, пипетки на 1-2 мл, резиновые груши, спиртовки, спиртовые тампоны; набор красок для окраски по методу Грама.

Индекс - то количество СПМО, которое содержится в 1 л воды или в 1 мл субстрата.

Готовят 10% рыбную суспензию, из нее делают разведения. Из суспен­зии и разведении 1:10,1:100 засевают по 1 мл в пробирки со средой Кессле­ра. Таким образом, в среду вносятся 0,1 г, 0,01 и 0,001 г исследуемой рыбы.

Таблица 12

Определение бактерий группы кишечных палочек в свежей рыбе.

 

Этапы исследования	Номера пробирок
	1	2	3
Засеваемые объемы, мл	1 (0.1 г)	1 (1: 10) (0,01 г)	1(1: 100) (0,001 г)
Среда Кесслера, мл	9	9	9
Высев на среду Эндо (секторами)
Результат
Заключение

 

При учете результатов на среде Эндо изучают цвет выросших колоний. Если на секторах среды вы­росли темно-красные колонии, характерные для БГКП, то проводят под­тверждающие исследования путем микроскопии окрашенных по Граму маз­ков и постановки оксидазного теста. Для этого по 2-3 характерные колонии снимают петлей и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную реакти­вом. При отсутствии изменения цвета бумаги пробу на оксидазу считают от­рицательной и, наоборот, посинение бумаги в течение 1 мин свидетельству­ет о наличии активной оксидазы у бактерий. Обнаружение в мазках грамотрицательных палочек с отрицательным оксидазным тестом позволяет дать положительный ответ о наличии БГКП в исследуемой пробе рыбы.

 

Задание 4. Определение общей обсемененности рыбы коагулазоположительным стафилококком.

 

Материалы и оборудование. свежая рыба, ступки с пестиками – стерильные; колба с физраствором; стерильные чашки Петри, пробирки со средами: МПА и желточно-солевым агаром по 15 мл, пробирки со стерильной водой по 9 мл, пипетки на 1-2 мл, резиновые груши, спиртовки, спиртовые тампоны; набор красок для окраски по методу Грама.

 

Общую об­семененность рыбы коагулазоположительным стафилококком определяют путем высева из 10-кратных разведений продукта на желточно-солевой агар, последующего подращивания при температуре 37 °С и перерасчета по выросшим колониям количества микробов на 1 г продукта. Ход определения сводится к приготовлению разведении пробы продукта в соотношении 1:10,1:100, 1:1000 и высеву по 1 мл из каждого разведения в чашки Петри, которые заливают 10 мл расплавленного и охлажденного (до 45°С) желточно-солевого агара. Посевы инкубируют 48 ч при температуре 37°С.Кроме того, производят посев 0,1 мл исследуемой суспензии 1-го разведения на кровяной агар газоном.

Таблица 13

Определение общей обсемененности рыбы коагулазоположительным стафилококком (количество бактерий в 1 г)

 

Ингредиенты	Номера пробирок
	1	2	3
Засеваемые объемы, мл	1	1(1:100)	1(1:100)
Желточно-солевой агар, мл	15	15	15
Результат
Заключение

 

Здесь они образуют гемолитические и негемолитические непрозрачные колонии белого и золотистого цвета, гладкие с ровными краями, в диаметре 1-3 мм.

Для выявления плазмокоагулазы суточную агаровую культуру стафилококка суспендируют в цитратной кроличьей плазме. Результаты реакции регистрируют через несколько часов инкубации проб в термостате при 37 С. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка свидетельствует о наличии у исследуемого штамма фермента плазмокоагулазы.

Чашки культивируют при 37 С 18-24ч и затем выдерживают на свету для лучшего выявления пигмента при комнатной температуре.

 

Контрольные вопросы:

1. Какие показатели включает санитарно-микробиологическое исследование рыбы, их определение.

2. Какие микроорганизмы преобладают на поверхности рыбы.

3. По каким прави­лам осуществляется отбор проб рыбы для исследования.

4. Назовите токсигенные бактерии, способные выживать в соленой рыбе.

5. Расскажите об определение общей микробной обсемененности рыбы.

Занятие 5.