РПГА в диагностике брюшного тифа, паратифов, других сальмонеллезов и дизентерии

Кровь берут с соблюдением правил асептики из пальца с помощью оспопрививательных игл или шприцом из вены в стерильную пробирку. После образования сгустка его отделяют от стенок стеклянной палочкой или пастеровской пипеткой и ставят пробирку в холодильник. Не позднее чем через 24 часа после взятия крови отсасывают сыворотку. Если сыворотка содержит примесь эритроцитов, ее центрифугируют.

Для постановки РПГА удобно использовать пластмассовые планшеты с лунками*(20), в которых готовят последовательные двукратные разведения исследуемых сывороток. С этой целью вначале в лунки планшета наливают по 0,5 мл ИХН. Отдельно разводят в 50 раз исследуемую сыворотку (например, 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл ИХН), 0,5 мл сыворотки в этом разведении вносят в первую лунку. Содержимое лунки тщательно перемешивают градуированной пипеткой и 0,5 мл переносят во вторую лунку, а из второй после перемешивания - в третью и т.д. Обычно достаточно таким способом приготовить ряд из 5-6 разведений (до разведения 1:1600 - 1:3200). Из последней лунки 0,5 мл содержимого выливают и вносят во все лунки чистой пипеткой по 0,25 мл необходимого эритроцитарного диагностикума, ампулу с которым перед этим тщательно взбалтывают до полного исчезновения осадка эритроцитов. С целью экономии диагностикумов их можно вносить по 3 капли (не по 0,25 мл, а по 0,15 мл). Пластины осторожно несколько раз встряхивают до получения гомогенной взвеси эритроцитов и ставят на 2-3 часа в термостат при 37°C или на ночь при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

Контролями диагностикума служат: 1) постановка реакции со стандартной иммунной сывороткой, вложенной в каждую упаковку диагностикума, - реакция должна быть положительной до разведения, указанного на ампуле с сывороткой; 2) постановка реакции с 0,5 мл ИХН в 2-х лунках - реакция должна быть отрицательной.

Реакция гемагглютинации считается положительной в том случае, если эритроциты полностью агглютинировались и расположены равномерно по дну лунки либо наряду с равномерно расположенными небольшая часть эритроцитов оседает в центре лунки в виде ровного колечка или "пуговки". Иногда при положительной реакции края агглютината в лунках могут слегка сползать, и он принимает вид "зонтика". При отрицательном результате агглютината нет, а эритроциты оседают в центре лунки в виде "пуговки" или ровного колечка.

При необходимости определения IgG-антител следует использовать L- или DL-цистеин как солянокислый, так и "свободный". Препарат должен быть чистым и содержать золу в виде сульфатов не более 0,2%, аммиак - не более 0,05%. Этим требованиям отвечает венгерский цистеин. Непосредственно перед обработкой сывороток готовят раствор цистеина (7 мг на 1 мл растворителя - для L-цистеина и 20 мг - для DL-цистеина). При этом солянокислый цистеин растворяют в 0,1 N растворе едкого натрия с таким расчетом, чтобы pH готового раствора был равен 7,0-7,2. "Свободный" цистеин сначала растворяют в половинном количестве ИХН, затем доводят pH до 7,0-7,2 0,1 N раствором едкого натрия и вновь доливают до нужного объема ИХН, т.к. "свободный" цистеин значительно слабее, чем солянокислый, сдвигает pH раствора в кислую сторону. Допустимо использование отечественного цистеина, который предварительно должен быть проверен, причем эталоном может служить венгерский или другой проверенный цистеин. С целью проверки pH применяют индикаторную бумагу. Раствор цистеина не может храниться длительное время, поэтому следует вначале приготовить необходимое разведение сыворотки.

Исследуемую сыворотку в разведении 1:5 смешивают с равным объемом цистеина, помещают в небольшие пробирки или флаконы и плотно закрывают их резиновыми пробками (лейкопластырем). Объем пробирок (флаконов) должен быть таким, чтобы между содержимым и пробкой оставалось минимальное свободное пространство во избежание инактивации цистеина кислородом воздуха. Пробирки с сыворотками, обработанными цистеином, выдерживают в течение 18-20 часов в термостате при 37°C. В таких же условиях выдерживают вторую часть исследуемой сыворотки (без цистеина), разведанную 1:10 с применением ИХН. На следующий день обе части сыворотки титруют, начиная с разведения 1:20. В качестве основы для титрования сывороток, обработанных цистеином, необходимо использовать забуференный ИХН (фосфатный буфер, pH 7,0-7,2), однако предпочтительней готовить ИХН на нормальной, прогретой при 66°C в течение 30 минут сыворотке (кроличьей, лошадиной, крупного рогатого скота). Нормальную сыворотку добавляют из расчета 1 мл на 100-200 мл ИХН (pH 7,0-7,2) при условии, что в принятом разведении нормальной сыворотки отсутствуют антитела к применяемым диагностикумам. Это проверяют предварительно для каждой новой серии нормальной сыворотки.

С целью диагностики брюшного тифа и паратифов сыворотки следует титровать с помощью O-диагностикумов серогрупп A, B и D, а также H-диагностикумов I фазы a, b, d и Vi-диагностикума. Четкое нарастание в динамике болезни титра суммарных антител к определенным антигенам и особенно увеличение уровня IgG-антител, устойчивых к цистеину, дает веские основания для подтверждения клинического диагноза. Необходимо учитывать, что при паратифе A титры O-антител на протяжении заболевания могут быть ниже, чем при брюшном тифе и паратифе B.

В случае позднего поступления больного в стационар (в разгар болезни) условно диагностическим титром суммарных O- и H-антител следует считать положительный результат в разведении не ниже 1:640, а для Vi-антител - 1:80 - 1:100. Минимальным условно диагностическим титром IgG O- и H-антител считают разведение 1:80, а для IgG Vi-антител - 1:40 (при паратифе A "диагностические титры" могут быть в 2 раза ниже).

При позднем серологическом обследовании больного и отсутствии бактериологического подтверждения диагноза целесообразно исследовать сыворотку в периоде реконвалесценции, чтобы выявить снижение общего титра антител и уменьшение удельного содержания цистеинустойчивых IgG-антител, что также может помочь поставить правильный диагноз.

С целью диагностики сальмонеллезов сыворотки вначале титруют комплексным диагностикумом (серогрупп A, B, , , D и E). При нарастании уровня антител или достаточно высоком титре (для взрослых - не ниже 1:400, для детей до полугода - 1:100, для детей от 6 мес. до 1 года - 1:200) следует повторить исследование сыворотки со всеми групповыми O-диагностикумами и поставить РПГА с цистеиновой пробой. Это необходимо для уточнения этиологии заболевания и потому, что комплексный диагностикум недостаточно специфичен. Условно диагностическим титром суммарных антител считают положительный результат реакции в разведении 1:400, а цистеинустойчивых IgG-антител - 1:80 (для детей до 1 года - 1:20).

С целью диагностики дизентерии сыворотки титруют с эритроцитарными диагностикумами Флекснера (из S. flexneri 1-5), Зонне (из S. sonnei), Ньюкасл (из S. flexneri 6), Григорьева-Шига (из S. dysenteriae 1) и Штуцера-Шмитца (из S. dysenteriae 2). Минимальным условно диагностическим титром к диагностикуму Флекснера для взрослых считают положительный результат реакции в разведении 1:400, для детей до 3 лет - 1:100, старше 3 лет - 1:200; для остальных диагностикумов - 1:200. В связи с большим числом неспецифических положительных результатов этой реакции, в особенности в отношении диагностикумов Флекснера и Зонне, достоверным положительным результатом следует считать не менее чем четырехкратное нарастание титра в динамике заболевания, а также наличие титра цистеинустойчивых антител 1:80 и выше.

РПГА с цистеином может оказаться полезной для постановки правильного диагноза в случаях смешанной инфекции и при выделении двух или нескольких представителей энтеробактерий, этиологическая роль каждого из которых не ясна. При истинной микст-инфекции антитела и особенно цистеинустойчивые будут нарастать к каждому из предполагаемых возбудителей. Если же к какому-то из предполагаемых возбудителей нарастание антител, а в том числе IgG, не будет выявлено и при этом отсутствуют клинические симптомы заболевания, то можно считать, что выделение возбудителя носит случайный, транзиторный характер.

В случае формирования острого и особенно затяжного бактерионосительства (при брюшном тифе, паратифах, реже при сальмонеллезах и других инфекциях) характерно выраженное нарастание IgG-антител, при этом основное значение имеет не абсолютный титр антител, а относительное содержание в сыворотке цистеинустойчивых антител. Если обработка цистеином не снижает титр либо снижает его только на одно, максимум на два разведения, это свидетельствует о значительном содержании в сыворотке IgG-антител, у такого обследованного следует заподозрить острое или хроническое бактерионосительство (при отсутствии клинических проявлений). При длительном бактерионосительстве титр O-антител может быть и низким (иногда 1:20 - 1:40), но эти антитела практически целиком определяются IgG-антителами. Для хронических носителей тифозных бактерий характерны довольно высокие титры Vi-антител (в большинстве случаев выше 1:80) и H-антител (1:320 и выше), которые почти не снижаются при обработке цистеином.

Отмеченная закономерность может нарушаться у хронических носителей тифозных бактерий, инвазированных описторхами. Это необходимо принимать во внимание при обследовании населения территорий, на которых распространен описторхоз.

РПГА с цистеином может быть применена с целью контроля прекращения бактерионосительства. Если на фоне прекратившегося бактериовыделения значительно снизится титр антител и особенно цистеинустойчивых IgG, то можно предположить, что произошло освобождение организма от возбудителя. Прекращение бактерионосительства чаще наблюдается при дизентерии, сальмонеллезах, значительно реже - при брюшном тифе.

Для транзиторных бактерионосителей характерен невысокий титр антител, обусловленный IgM. Если после обработки цистеином в сыворотке остаются IgG-антитела в титре 1:40 и выше, то у такого лица можно предполагать наличие либо субклинической формы инфекции, либо продолжающееся бактерионосительство.

Некоторое повышение титра IgG-антител может происходить в результате многократной специфической вакцинации, поэтому при анализе результатов реакции следует учитывать прививочный анамнез.

При выдаче ответа указывают: "Реакция гемагглютинации с диагностикумом ___________________ отрицательная"; "Реакция гемагглютинации с диагностикумом ___________________ положительная до титра _________"; "Реакция гемагглютинации с цистеиновой пробой с диагностикумом _______________ отрицательная"; "Реакция гемагглютинации с цистеиновой пробой с диагностикумом ________________ положительная до титра ____________".