Таблица 50. Схема определения колициногенной активности S. sonnei по Эбботу и Шеннону (в модификации Н.А. Смирновой-Мутушевой, 1968)

Обозначения: "+" - торможение роста; "-" - отсутствие торможения; X - вариабельные результаты.

Примечание.* Условные обозначения индикаторных штаммов соответствуют следующим наименованиям оригинальных штаммов: 31 - S. sonnei 2; 32 - S. sonnei 56; 33 - S. sonnei 17; 37 - S. sonnei 56/98; 39 - S. sonnei R6; 8218 - S. dysenteriae 2 N 19; 41 - S. sonnei 3/64; 42 - S. sonnei 2/15; 43 - S. sonnei R5; 44 - E. coli K-12 ROW; 34 - S. sonnei 2M; 35 - S. sonnei 38; 36 - S. sonnei 56/56; 38 - S. sonnei RT; 40 - S. sonnei 2/7.

Исследование проводят способом перекрестных посевов. Для этого суточную бульонную культуру исследуемого штамма сеют на агаровую пластинчатую среду в виде двух параллельных полос, располагающихся по обе стороны предполагаемой линии диаметра чашки таким образом, чтобы расстояние между полосами посева составляло 3-4 см. В качестве питательной среды (в чашках) применяют коммерческий питательный агар "Д" или приготовленный в лаборатории 1,5-% СПА на гидролизате Хоттингера с конечным содержанием аминного азота в среде 130-150 мг и pH 7,4. С целью предотвращения роста воздушной флоры к агару добавляют раствор генцианвиолета (2-4 капли 0,1% водного раствора на 100 мл среды), известно также, что он стимулирует колицинопродукцию.

Чашки с указанными посевами инкубируют при 37°C в течение 48 часов. Этот срок необходим для накопления в среде колицинов в концентрации, достаточной для проявления их действия на индикаторные штаммы. После инкубации в крышку чашки наливают 0,5 мл хлороформа и закрывают ее второй половиной той же чашки (с выросшей культурой), выдерживая экспозицию 40-50 мин. Обезвреженную культуру снимают узким краем стерильного предметного стекла, стараясь сохранить целостность агаровой поверхности; далее под прямым углом к линиям посева исследуемого штамма на агар наносят бактериологической петлей 4-х часовые бульонные культуры индикаторных штаммов в виде поперечных полос. Посевы делают таким образом, чтобы полосы посевов на одной половине чашки помещались против интервалов между полосами посевов на другой половине чашки. Рекомендуется постоянно соблюдать однотипный порядок расположения посевов индикаторных штаммов, что позволяет не делать специальные пометки на чашках. При использовании 10 или 15 индикаторных штаммов соответственно делают на каждой половине чашки 6 и 4 или 8 и 7 полос.

Чашки с посевами индикаторных штаммов инкубируют при 37°C 18-20 часов. При учете результатов прежде всего необходимо установить, является ли исследуемый штамм колициногенным. Показателем колициногенности является торможение роста индикаторного штамма 44 (E. coli K-12 ROW), чувствительного ко всем известным колицинам, кроме колициногеновара 7 типа (к нему чувствителен штамм 33). Наряду с этим может иметь место торможение роста еще каких-либо индикаторных штаммов.

При изучении спектра зон задержки положительным результатом считают наличие зоны торможения роста индикаторных бактерий более 4 мм. Сопоставляя полученные результаты со схемой (табл. 50) устанавливают условный колициногеновар. Однако литический спектр может не соответствовать ни одному из условных колициногеноваров. Такие штаммы обозначают как нетипируемые.

При применении метода колициногенотипирования необходимо проводить периодический контроль за стабильностью свойств индикаторных штаммов с помощью набора стандартных колициногенных штаммов.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

Типирование шигелл по чувствительности к колицинам

Чувствительность S. sonnei и других видов шигелл к колицинам (колициновар) связано со способностью бактерий адсорбировать на рецепторах поверхности клетки определенные колицины; колицины (или группа родственных колицинов) адсорбируются на строго специфических рецепторах.

Этот метод применяют к разным видам шигелл (в целом занимающих одно из первых мест по чувствительности к колицинам среди всех родов энтеробактерий), т.к. они мало отличаются по удельному весу колициночувствительных штаммов. Вместе с тем использование этого метода в эпидемиологических целях ограничено из-за относительной нестабильности колициноваров.

Для определения колициноваров используют 11 эталонных колициногенных штаммов из коллекции P. Frederiq. Перечень их представлен в таблице 51. Перед началом исследования готовят чашки с 1,5-% СПА, разливая его по 20-25 мл на чашку с добавлением генцианвиолета (2-4 капли 0,1% водного раствора на 100 мл среды). Определение проводят в двух (дублирующих) чашках. Дно каждой чашки со средой разделяют на 11 квадратов - по числу эталонных штаммов, обозначая их условно 1, 2, 3 и т.д. соответственно порядковому номеру при использовании этих штаммов. В квадраты сеют последовательно уколом петли суточные бульонные культуры указанного набора колициногенных штаммов. Чашки с посевами инкубируют при 37°C в течение 22-24 часов, затем обеззараживают однократно хлороформом, как было описано выше (удаление обезвреженной бактериальной массы не требуется). По окончании этой процедуры 2 капли 6-часовой бульонной культуры исследуемого штамма вносят в пробирку с 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 46-48°C полужидкого (0,7%) СПА и после перемешивания агар наслаивают на 1-й слой агара. В результате предшествовавшего культивирования посевов эталонных колициногенных штаммов в толще 1-го слоя агара колицины диффундировали в среду вокруг макроколоний.