Таблица 7 - Взаимозависимость между адгсзинами

                       энтеротоксинами и хозяевами

 

Тип адгезинов	Главные хозяева штаммов	Продуцируемые энтеротоксины
		ТС	ТЛ	ТСиТЛ
К 88	Поросята	+	+	+
К 99	Телята, ягнята	+	-	-
987 Р	Поросята	+	-	-
F41	Телята	+	-	-

     

Поскольку, как отмечалось выше, в большинстве случаев корреляция между энтеротоксигенностыо штаммов эшерихий и их серогрупповой при­надлежностью отсутствует, проводить диагностику заболеваний, вызван­ных ЕТЕС с помощью обнаружения у них О- или К-антигенов, нецелесооб­разно. Для этой цели необходимо выявлять либо адгезины, либо непосред­ственно энтеротоксины.

 

Определение энтеротоксигенных свойств Е. coli проводят на изолиро­ванных петлях тонкого кишечника кролика или морской свинки. Метод основан на феномене расширения кишечной петли за счет скопления в ее просвете жидкости, что и является показателем токсигенной активности испытуемых штаммов.

При использовании кроликов (классическая модель) отбирают клини­чески здоровых животных массой 2,0-2,5 кг, выдерживают их на голод­ной диете со свободным доступом к воде в течение 36-48 часов, после чего оперируют под эфирным наркозом с фиксацией в спинном положении. Общепринятыми хирургическими методами осуществляется лапаротомия, тонкий кишечник извлекается на стерильную салфетку и орошается физио­логическим раствором через каждые 5-7 минут операции. На кишечник накладывают шелковые лигатуры так, чтобы образовалось 8-12 сегмен­тов по 10 см с промежутками между ними в 3-5 см. В опытные сегменты вводят испытуемый материал в объеме 2 см³ (суспензия испытуемого штам­ма эшерихий в физиологическом растворе концентрацией 1 млрд. микроб­ных клеток в 1 мл. Культуру выращивают на плотных средах в течение 16-24 часов). В контрольные сегменты вводят по 2 см³ стерильного физио­логического раствора. Петли кишечника вправляют в брюшную полость, брюшину с брюшными мышцами зашивают непрерывным швом. Через 16 - 18 часов кроликов усыпляют. Извлекают кишечник, из каждого опытного сегмента жидкость переносят в мерный цилиндр. Индекс дилатации опре­деляют соотношением объема скопившейся жидкости в сегменте к длине этого сегмента. Энтеротоксигенными считают штаммы, дающие индекс дилатации 1 и более.

При использовании морских свинок тест выполняется аналогичным образом. При этом отбирают животных массой 250-500 г. Лигатуры накладывают на тощую кишку так, чтобы образовались сегменты дли­ной 1,0-1,5 см. Исследуемый материал вводят в объеме 0,1см³. Энтеротоксигенными признают штаммы, дающие индекс дилатации 0,5 и бо­лее.

В большей степени научное, чем диагностическое значение имеет обна­ружение непосредственно ТЛ- или ТС-энтеротоксинов. Для обнаружения ТЛ-энтеротоксина в настоящее время используют тест отека лап белых мышей, кожную пробу на кроликах, реакцию агрегации тромбоцитов, ре­акцию отсутствия прилипания лейкоцитов в вате, реакцию латекс-агглю­тинации, РИД по Манчини и др. ТС-энтеротоксин выявляют в анальной пробе на 15-дневных мышатах-сосунах или в пробе на 15-дневных кури­ных эмбрионах.

Патогенные эшерихии сероваров О157:Н7 и О157:Н-, вызывающие ди­арею животных с признаками геморрагического гастроэнтерита, бактерии, образующие адгезивный антиген F 18 и вызывающие отечную болезнь по­росят, продуцируют вероцитотоксин.

 

Лабораторная диагностика сальмонеллезов

      Сальмонеллезы — группа инфекционных бактериальных болезней, преимущественно мо­лодняка сельскохозяйственных животных, в том числе и птиц, промысло­вых и мелких домашних животных.

  У животных сальмонеллезы могут проявляться в виде трех основных форм: первичные, вторичные и бактерионосительство.

   Первичные сальмонеллезы при остром течении характеризуются лихо­радкой, явлениями септицемии, токсикоза и поражением кишечника, а при хроническом — воспалением легких. У взрослых животных (кобыл, овец и реже у коров) могут наблюдаться аборты.

Вторичные сальмонеллезы осложняют течение основного заболевания (чума свиней, пастереллез и др.), при этом характерные для сальмонеллезов признаки обычно слабо выражены или отсутствуют.

Бактерионосительство сальмонелл характеризуется тем, что животные, будучи внешне здоровыми, выделяют бактерии во внешнюю среду с фека­лиями и мочой. У таких животных возбудителя обнаруживают главным об­разом в печени (в желчи, в слизистой желчного пузыря, в лимфатических узлах печени), в мезентериальных лимфатических узлах, в содержимом сле­пой кишки.

У человека сальмонеллез протекает в виде пищевых токсикоинфекций (острых кишечных инфекций).

Возбудители сальмонеллезов относятся к роду Salmonella семейства Еnterobacteriaceae. В настоящее время все сальмонеллы разделяют на два вида. Вид S. bongori содержит менее 10 очень редких сероваров. Все ос­тальные 2500 сероваров выделены внутри вида S. choleraesuis, который по фенотипическим и генетическим критериям разделен на 6 подвидов: S. choleraesuis subsp. arizonae; S. choleraesuis subsp. choleraesuis; S. choleraesuis subsp. diarizonae; S. choleraesuis subsp. houtenae; S. choleraesuis subsp. indica и S. choleraesuis subsp. salamae. Все серовары внутри подвида choleraesuis имеют названия, тогда как в других подвидах серовары (за ис­ключением некоторых в подвидах salamae и houtenae) не имеют названий.

Диагностическим лабораториям рекомендовано для имеющих названия сероваров бактерий рода Salmonella использовать эти названия, а не имею­щие названий серовары обозначать с помощью антигенной формулы и ука­занием подвида. 

Лабораторная диагностика сальмонеллеза основана на результатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой и люминесцентной микроскопии, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.

     Бактериологическое исследование

    Материал для исследования. Для посмертной диагностики в лабораторию направляют свежий труп мел­ких животных, в том числе и птиц, целиком, от трупов крупных живот­ных — трубчатую кость, долю печени с желчным пузырем, почку, селезен­ку, брыжеечные лимфоузлы, пораженные участки легких, слепую кишку с содержимым; в случае аборта — свежий плод.

Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, носовую слизь, истечения из родовых путей.

Для получения гемокультуры на 1-4-й день болезни (не позже, т.к. пе­риод бактериемии при сальмонеллезах короткий) от животных может быть взята кровь, а для серологического исследования по РА — сыворотка кро­ви. От птиц берут кровь для постановки кровекапельной реакции агглюти­нации или кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации для диаг­ностики пуллороза-тифа.

 

    Микроскопическое исследование исходного материала. Изпоступившего материала готовят мазки, окрашивают по Граму. Саль­монеллы являются грамотрицательными, мелкими палочками с закруглен­ными концами, от 1 до 4 мкм длиной и 0,5-0,8 мкм шириной. Не образуют спор и капсул.

Для люминесцентной микроскопии готовят мазки-отпечатки из патологи­ческого материала и обрабатывают их в соответствии с «Наставлением по применению комплексной и групповых сальмонеллезных флуоресцирующих сывороток» (для прямого метода иммунофлюоресценции).

 

   Выделение и идентификация культур сальмонелл. Сальмонеллы — факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы; обла­дают и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная тем­пература культивирования 37° С, рН среды 7,2-7,4, хорошо растут на обычных питательных средах.

Исследуемый материал высевают на обычные МПА и МПБ, на плот­ные селективные среды, а в ряде случаев (главным образом при исследова­нии фекалий и при получении гемокультуры) в среды накопления (см. табл. 12). Из селективных наиболее часто используют среды Плоскирева, Эндо, Левина, висмут-сульфит агар, а из сред накопления — Мюллера, Кауфма­на, Киллиана.

  Для получения гемокультуры кровь засевают в пробирку с 20%-ным жел­чным МПБ. Засеянные чашки Петри и пробирки инкубируют 18-20 часов при 37° С. После этого просматривают посевы на плотных средах в чаш­ках Петри и отбирают подозрительные колонии, наряду с этим делают вы­севы с жидких сред накопления на плотные селективные среды, которые инкубируют при 37° С в течение 18-24 часов.

 

  Характер роста сальмонелл на питательных средах. В МПБсальмонеллы дают рост в виде равномерного помутнения сре­ды, на МПА образуют небольшие, диаметром 2-4 мм, гладкие выпуклые прозрачные или серо-голубоватые колонии с ровными краями. Некото­рые серовары (S. abortus equi, S. abortus ovis, S. typhisuis) образуют более мелкие колонии диаметром около 1 мм. На среде Эндо колонии сальмо­нелл слегка розовые, прозрачные, на средах Плоскирева и Мак-Конки — бесцветные, но выглядят более плотными и мутноватыми, чем на МПА. На агаре Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных колоний, иног­да с фиолетовым оттенком. На висмут-сульфит агаре почти все сальмо­неллы образуют черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание участка среды под колонией в чер­ный цвет. Отдельные немногочисленные серовары составляют исключе­ние, и на висмут-сульфит агаре образуют светлые или светло-зеленова­тые колонии.

 

      Морфология клеток сальмонелл в культуре. В мазках, приготовленных с питательных сред, сальмонеллы обнару­живают в виде грамотрицательных, мелких палочек с закругленными концами, от 1 до 4 мкм длиной и 0,5-0,8 мкм шириной. В мазках распо­лагаются одиночно, беспорядочно, иногда попарно. Не образуют спор и капсул. Обладают, как правило, выраженной подвижностью за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Некоторые серовары (S. gallinarum pullorum) всегда неподвижны, могут встречаться непод­вижные мутанты и среди других сероваров.

 

Идентификация сальмонелл по ферментативным признакам. Чистые культуры бактерий с характерными для сальмонелл культуральными свойствами с целью установления родовой принадлежности засева­ют в дифференциально-диагностические среды для определения фермента­тивных свойств. Критерии для родовой идентификации сальмонелл приве­дены в таблице 14.

К роду Salmonella относят бактерии: оксидазоотрицательные; катала-зоположительные; не образующие индол; дающие отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра (желтое окрашивание среды); положительную пробу с метиловым красным (среда окрашивается в розово-красный цвет); способ­ные расти на среде Симмонса с цитратом; лизин- и орнитиндекарбоксилазо-положительные; образующие H₂S; не сбраживающие лактозу, сахарозу; не расщепляющие мочевину; не разжижающие желатину. По аргининдегидрогеназе, способности расти в присутствии KCN и использованию малона-та сальмонеллы различаются. Как правило, сбраживаемые ими углеводы включают L-арабинозу, D-ксилозу, мальтозу, D-маннитол, D-маннозу, L-рамнозу, D-сорбитол, трегалозу и глюкозу.

Частота выявления позитивных реакций при изучении некоторых био­химических характеристик сальмонелл представлена в таблице 8.

             

Таблица 8 - Биохимические свойства рода Salmonella

 

Признаки	% позитивных реакций
Ферментация глюкозы	100%
Образование газа на среде с глюкозой	91,9%
H2S	91,6%
Индол	1,1%
Арабиноза	89,2%
Сорбит	94,1%
Дульцит	86,5%
Маннит	99,7%
Рост на среде Симмонса	80,1%

    

На основании биохимических характеристик возможна не только родо­вая идентификация сальмонелл, но и определение их видовой и подвидовой принадлежности (таблица 9).

Наибольшее значение для ветеринарии имеют сальмонеллы подвидов choleraesuis и arizonae, объединяющие более 80% всех сальмонелл.

Таблица 9 -Дифференциация видов и подвидов бактерий рода

Salmonella, первоначальные источники их выделения

 

Тесты	Вид	Подвиды вида S. choleraesuis
	S. bongori	Cholerae-suis	Salamae	Ari-zonae	Diari- zonae	Houtenae	Indica
b-галактозидаза (ONPG-тест)	+	-	(-)	+	+	-	+/-
Образование кислоты из: лактозы	-	-	-	(-)	(+)	-	(-)
дульцита	-	+	+	-	-	-	+/-
муката	+	+	+	+	+/-	-	+
галактоуроната	+	-	+	-	+	+	Н.Д.
Утилизация мальтозы	-	-	+	+	+	-	+
d-тартрата	-	+	+/-	-	(-)	+/-	+
Гидролиз желатины	-	-	+	+	+	+	+
Первоначальные ис­точники выделения: теплокровные живот­ные;	-	+	-	-	-	-	Н.Д.
холоднокровные и объекты внешней сре­ды	+	-	+	+	+	+	Н.Д.

Примечания: Данные по подвиду Indica приведены по Bergeys Manual of

Determinative Bacteriology (1994).

Обозначения:

«-» — 0-10% штаммов положительные; «(-)» — 11-25% штаммов положительные; «+/-» — 26-75% штаммов положительные; «(+)» — 76-89% штаммов положительные; «+» — 90-100% штаммов положительные.

 

Учитывая возможность отклонений отдельных из перечисленных при­знаков, следует отметить, что биохимическая идентификация сальмонелл является лишь первым этапом работы в этом направлении. Окончательную идентификацию выделенных штаммов осуществляют с учетом последую­щего изучения их антигенной структуры.

 

Серологическая идентификация сальмонелл. Сальмонеллы имеют сложное антигенное строение. Основными антигена­ми, имеющими значение для идентификации сальмонелл на уровне рода, опре деления их видовой, серогрупповой и серовариантной принадлежности, явля­ются соматический или О-антиген и жгутиковый или Н-антиген.

О-антиген расположен на поверхности бактериальной клетки ипред­ставляет собой термостабильный (не разрушается при кипячении в течение 2 часов) фосфолипидо-полисахаридный комплекс. Он не однороден исо­держит различные антигенные факторы (дидезоксигексозы, или иначе полиозиды) на концах полисахаридных цепей, что обуславливает специфич­ность О-антигена в серологических реакциях.

В соответствии с содержанием тех или иных О-антигенов сальмонеллы делят на серологические группы, обозначаемые заглавными буквами латин­ского алфавита. Отдельные антигенные факторы О-антигена обозначаются арабскими цифрами. Некоторые антигенные факторы О-антигена (далее про­сто О-антигены) называют главными О-антигенами, т.к. они встречаются только в одной из групп сальмонелл и именно они определяют групповую принадлежность бактерий. Другие О-антигены называют малыми, т.к. они встречаются в нескольких или даже многих группах сальмонелл и, следова­тельно, не могут определять их групповую принадлежность. В настоящее время выделено более 50 О-групп сальмонелл.

Одним из компонентов О-антигена является Vi-антиген — полимер N-ацетиламино-гексуроновой кислоты. Он обнаруживается у отдельных сероваров сальмонелл (S. dublin, S. paratyphi и др.) и некоторых других бакте­рий семейства энтеробактерий (Escherichia, Citrobacter). Vi-антиген затруд­няет серологическую идентификацию сальмонелл в РА, т.к. препятствует агглютинации бактерий в О-сыворотках.

Vi-антиген термолабилен. Он полностью разрушается при кипячении в течение 10 минут, частично инактивируется при нагревании при 60° С в течение часа и под действием фенола, чувствителен к действию соляной кислоты и этанола. Наиболее полное его развитие у соответствующих се-роваров происходит при температуре 37° С.

Жгутиковые или Н-антигены сальмонелл могут существовать в двух, выявляемых в серологических реакциях, фазах: первой и второй (или «спе­цифической» и «неспецифической»).

Антигенные факторы 1-й фазы обозначаются прописными буквами ла­тинского алфавита, антигены 2-й фазы - арабскими цифрами или прописны­ми буквами латинского алфавита с арабскими цифрами. Сальмонеллы, у которых Н-антиген представлен двумя фазами, называются двухфазными, а имеющие антигенные факторы 1-й фазы-монофазными.

Помимо перечисленных основных антигенов, у сальмонелл обнаруже­ны и другие антигены. Среди них — М-антиген (слизистый). Он выявляется у некоторых слизистых штаммов сальмонелл сероваров S. choleraesuis, S. dublin, S. anatum и др. М-антиген — кислый полисахарид. Он нераство­рим в воде, разрушается под действием кислоты и этанола, обладает сла­быми антигенными свойствами.

У ряда сероваров сальмонелл (S. typhimurium, S. choleraesuis, S. stanley, S. anatum и др.) показано наличие белково-полисахаридного комплекса, отнесенного к К-антигену. Он устойчив к действию кислоты, этанола и обладает выраженными антигенными свойствами.

У сальмонелл имеется несколько видов антигенных вариаций, знание которых необходимо для получения однородных результатов идентифика­ции и правильной их интерпретации.

Н-О-вариации — переход из жгутиковой НО-формы в безжгутиковую О-форму. Встречается редко, но такой переход почти всегда необратим. Некоторые серовары сальмонелл (S. gallinarum-pullorum) существуют только в О-форме.

S-R-вариации — переход от гладких S-форм к шероховатым R-формам, сопровождающийся качественными и количественными изменениями О-антигена.

О-вариации — количественные изменения О-антигена. Наиболее часто изменениям подвергаются О-антигены 1,6, и 12. Этот тип вариаций антиге­нов связывают с фаговой конверсией сальмонелл.

V-W-вариации (или Vi-вариации) — количественные изменения Vi-антигена, влияющие на агглютинабельность культур, содержащих этот анти­ген (V-форма — О — инагглютинабельна из-за большого количества Vi-антигена, W-форма не содержит Vi-антиген и агглютинируется О-сыворотками, VW — форма является промежуточной, т.е. содержит Vi-антиген, но является О-агглютинабельной).

Н-вариации — качественные изменения жгутиковых антигенов, в ре­зультате чего отдельные антигенные комплексы, входящие в 1-ю и 2-ю фазы, могут присутствовать или отсутствовать.

При идентификации сальмонелл следует помнить и то, что они могут иметь общие антигены не только в пределах их отдельных О-групп, но и с представителями других родов семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Klebsiella, Citrobacter и др.). Несмотря на мозаичность и вариабельность антигенной структуры сальмонелл, при их серологической идентификации во внимание принимаются лишь два ос­новных антигена (О и Н). Этот принцип положен в основу диагностической антигенной схемы Кауфмана-Уайта. В этой схеме, в соответствии со струк­турой О-антигенов, сальмонеллы распределены по О-группам с различным числом сероваров, расположенных в пределах этих О-групп в алфавитном порядке в соответствии с обозначением их Н-антигенов 1-й фазы. Факти­чески схема Кауфмана-Уайта представляет собой каталог антигенов саль­монелл, имеющих первостепенную диагностическую ценность. Краткая схема Кауфмана-Уайта, касающаяся антигенной структуры групп саль­монелл, в которые входят патогенные сероварианты бактерий, представ­лена в таблице 10.