плотных дифференциальных средах
Среда
|
Дифференцирующие компоненты |
Индикатор | Цвет колоний в зависимости от | |||
Ферментации углеводов | Образования сероводорода | |||||
+ | - | + | - | |||
Плоскирева | Лактоза | Нейтральный красный | Розовый, красный | Бесцветный | ||
Висмут-сульфат | Глюкоза, сульфит висмута | Сульфат железа | Черный, зеленый | Бесцветный | ||
Левина | Лактоза | Эозин, метиленовый синий | Темно-синий, черный с металлическим блеском | Бесцветный | ||
Эндо | Лактоза | Основной фуксин | Красный с металлическим блеском | Бесцветный | ||
Мак-конки | Лактоза | Нейтральный красный | Розовый, красный | Бесцветный |
Дифференциация некоторых родов энтеробактерий
При дифференциации родов энтеробактерий ключевое значение имеет изучение биохимических и физиологических свойств, являющихся генетически более стабильными (табл. 3). Кроме сред Гисса с соответствующими индикаторами и реактивами, для идентификации энтеробактерий могут быть использованы различные диагностические системы, позволяющие сократить и упростить исследования. Так, системы индикаторные бумажные (СИБ), представляющие собой диски или полоски хроматографической бумаги с необходимыми субстратами и индикаторами, а также диски из фотопленки с желатином, выпускаются в виде двух наборов (изготовитель — предприятие по производству бактерийных препаратов Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии). Набор «А» (малый) предназначен для межродовой дифференциации энтеробактерий по 9 основным биохимическим свойствам: утилизации цитрата натрия, малоната натрия, ферментации лактозы, наличию (β-галактозидазы, фенилаланиндезаминазы, уреазы, лизиндекарбоксилазы, образование индола, сероводорода (табл. 4).
|
|
Системы мультимикротестов для идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, выпускаемые НПО «Алерген» (г. Ставрополь), включают два набора. Набор ММТ Е1 позволяет определить 12 ключевых ферментативных свойств энтеробактерий: образование сероводорода, индола, наличие лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы, утилизацию цитрата натрия, малоната натрия, маннита, сахарозы, лактозы, сорбита. Набор ММТ Е2 позволяет определить 12 дополнительных биохимических свойств, которые в сочетании с 12 ключевыми свойствами служат для видовой идентификации энтеробактерий: наличие аргининдегидролазы, бетта-галактозидазы, нитратредуктазы, утилизация инозита, дульцита, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раффинозы, салицина, глюкозы.
|
|
После изучения биохимических и физиологических свойств культур заключительным этапом анализа является серологическая идентификация. Антигены и антигенная структура сальмонелл, эшерихий, отчасти протея и клебсиелл изучены достаточно глубоко. Менее известна антигенная структура иерсиний.
Из числа известных антигенов энтеробактерий значение для серологической идентификации имеют три: О-, К- и Н-антигены.
О-антиген (соматический) расположен в клеточной стенке бактерий. Он представляет собой липополисахаридо-протеиновый комплекс. Липид связан с токсигенностью, протеин обусловливает иммуногенность, полисахарид является компонентом, определяющим антигенную специфичность.
Таблица 3 - Основные дифференцирующие признаки
некоторых родов и видов семейства Enterobacteriaceae
Признаки | Escherichia | Salmonella | Yersinia | Klebsiella pneumonia | Mor-ganella | Proteus | Serratia marces- cens | Hafnia |
Образование индола | + | - | Р | - | + | P | - | - |
Проба с метиленовым красным | + | + | + | X | + | + | X | X |
Реакция Фогес-Проскауера | - | - | - | + | - | P | + | X |
Цитрат (среда Симмонса) | - | + | - | + | - | P | + | - |
Образование H2S | - | + | - | - | - | P | - | - |
Гидролиз мочевины | - | - | Р | + | + | + | X | - |
Лизиндекарбоксилаза | + | + | Р | + | - | - | + | + |
Фенилаланиндезаминаза | - | - | - | - | + | + | - | - |
Орнитиндекарбоксилаза | X | + | Р | - | + | P | + | + |
Подвижность | + | + | +* | - | + | + | + | + |
Образование кислоты из: | ||||||||
лактозы | + | - | Р | + | - | - | - | - |
маннита | + | + | + | + | - | - | + | + |
Обозначения: «-» — 0—10% штаммов положительные; «х» — признак варьирует у различных штаммов; «+» — штаммов положительные; «р» — признак различен в разных видах рода; «+*» — подвижны при температуре ниже 30° С.
О-антиген устойчив к физико-химическим воздействиям. Выдерживает нагревание при 120° С в течение 2-2,5 часов, сохраняя основные антигенные свойства. На него не оказывают действия спирт, 0,5%-ный раствор формалина, нормальный раствор хлористоводородной кислоты (N HC1) и некоторые другие химические вещества.
Полноценный О-антиген характерен для S-форм (гладких) бактерий. Появление S => R мутаций затрудняет серологическую идентификацию энтеробактерий, а иногда делает ее невозможной.
К-антигены (оболочечные) являются кислыми полисахаридами. Расположены более поверхностно, чем О-антигены, вследствие чего иногда полностью их экранируют. Последнее может явиться причиной инагтлютинабельности живых К+ (плюс) бактерий в О-сыворотках (например, эшерихий).
К-антигены серологически обособлены и не дают перекрестных реакций. Они менее устойчивы к воздействиям различных факторов и являются неоднородными в этом отношении. В зависимости от свойств, устойчивости к химическим факторам и термоустойчивости К-антигены обозначают как А-, В-, L-, М- и Vi-антигены.
Н-антигены (жгутиковые) имеют белковую природу (флагеллин). Энтеробактерии являются перитрихами (жгутики расположены по всей поверхности клетки). В ряде случаев Н-антигены могут иметь фазовые вариации. Н-антигены термолабильны. Обработка 0,5-1%-ным раствором формалина не влияет на антигенные свойства Н-антигенов.
Характерные для каждого рода особенности О-, К- и Н-антигенов и антигенная структура бактерий представлены в соответствующих разделах. На основании данных об антигенной структуре энтеробактерий проводят их серологическую идентификацию.
Таблица 4- Определение рода энтеробактерий по тестам СИБ
Тест или субстрат | Роды энтеробактерий | |||||||||
Escher ichia | Edvard siela | Citro-bacter | Salmonella | Schig-ella | Klebsiella | Entero-bacter | Hafnia | Serratia | Proteus | |
Лактоза | +/х | - | +/- | P | P | P | + | - | - | - |
Р-галактозидаза | + | - | + | P | P | + | + | + | + | - |
Цитрат натрия | - | - | + | + | - | P | + | + | + | P |
Малонат натрия | - | - | P | P | - | P | + | P | - | - |
Мочевина | - | - | + | - | - | P | P | - | - | P |
Фенил аланин | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + |
Лизин | + | + | - | + | - | P | P | + | + | P |
Н2S и подвижность | - +/- | + + | P + | + + | - - | - - | - + | - + | - + | P + |
Индол | + | + | P | + | P | P | - | - | - | P |
|
|
Обозначения: «+» — положительная реакция; «-» — отрицательная реакция; «х» — реакция с запозданием и не всегда положительная; «Р» — реакция различна у разных видов рода; «р» — реакция различна у разных штаммов или сероваров.
Питательные среды
Консервирующие смеси используют при отсутствии необходимых условий и сред для посева в течение 3-4 ч с момента взятия материала. Обычно объем консервирующей смеси должен составлять 2/3 от объема материала, взятого для исследования.
Глицериновая смесь. Смешивают 1000 см3 изотонического раствора хлорида натрия и 500 см3 глицерина, затем добавляют 20%-ный раствор натрия фосфорнокислого (Na2HP04) в таком количестве, чтобы рН смеси соответствовал 7,8-8,0. Смесь стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин.
Фосфатная буферная смесь. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 0,45 г калия фосфата однозамещенного (КН2НР04) и 5,34 г натрия фосфата двузамещенного (Na2HP04). Стерилизуют 30 мин при 121° С.
Боратно-буфериый раствор. Смешивают 57 г кристаллической буры, 84 г борной кислоты, 99 г натрия хлорида. Затем 20 г полученной смеси растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды. Стерилизуют 10 мин при 121° С.
Среды обогащения
Желчный бульон. Применяют в качестве среды обогащения для сальмонелл, выделяемых из крови или материалов, не содержащих или содержащих в незначительных количествах другие виды бактерий.
Желчь крупного рогатого скота наливают в колбу и нагревают 1 ч текучим паром. После отстаивания фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. К 800 см3 МПБ добавляют 200 см3 желчи, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин.
Среда Мюллера. Используют для накопления сальмонелл.
К 4,5 г простерилизованного сухим жаром химически чистого мела (СаС03) добавляют 90 см3 МПБ или бульона Хоттингера и стерилизуют 30 мин при 121 ° С. Перед посевом к бульону асептически добавляют 2 см3 раствора Люголя (калия иодид — 25 г, йод кристаллический — 20 г, вода дистиллированная — до 100 см3) и 10 см3 раствора натрия тиосульфата (натрия тиосульфат — 50 г, вода дистиллированная до 100 см3). Смесь перемешивают и разливают по пробиркам.
|
|
Среда Кауфмана. Используют для накопления сальмонелл.
К 100 см3 стерильной среды Мюллера асептически добавляют 5 см3 стерильной желчи (желчь стерилизуют дробно, текучим паром 3 дня подряд по 20 мин) и 5 см3 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам. Не стерилизуют.
Среда Киллиана. Используют для накопления сальмонелл.
К 100 см3 стерильного МПБ или бульона Хоттингера (рН 6,7-6,9) непосредственно перед применением добавляют 1 см3 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого.
Селенитовая среда. Используют для накопления сальмонелл. Для приготовления используют два раствора. Раствор 1. К 950 см3 раствора фосфатов (натрия гидрофосфат безводный — 7 г, натрия дигидрофосфат безводный — 3 г) на дистиллированной воде добавляют 5 г пептона и 4 г лактозы. Разливают во флаконы по 50 см3 и стерилизуют текучим паром 2 дня подряд по 30 мин или 30 мин при 112° С. При приготовлении раствора количественное соотношение фосфатов подтитровывают так, чтобы при добавлении пептона и натрия селенита готовая среда имела рН 6,9-7,1. Раствор хранят при 4-10° С 1-2мес.
Раствор 2. В 40 см3 стерильной дистиллированной воды растворяют 4 г натрия гидроселенита (NaHSe03). Раствор готовят непосредственно перед приготовлением среды.
В каждый флакон с 50 см3 раствора 1 асептически добавляют 2 см3 раствора 2, перемешивают и разливают по пробиркам.
Магниевая среда. Используют для накопления сальмонелл. Для приготовления используют два раствора. Раствор 1. К 890 см3 дистиллированной воды добавляют 4,2 г пептона, 7,15 г натрия хлорида, 1,43 г калия дигидрофосфата (KH2PO4 и 9 см3 дрожжевого автолизата.
Раствор 2. В 90 см3 дистиллированной воды растворяют 35,7 г магния хлорида (MgCl2 х 6Н20). Растворы смешивают и добавляют 0,9 см3 0,5%-ного водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С.
Среда Минка. Используют для накопления эшерихий, обладающих адгезивными антигенами. Раствор 1 (фосфатный буферный раствор рН 7,5). Берут 1,36 г калия фосфорнокислого однозамещенного (КН,Р04), 10,1 г натрия фосфорнокислого двузамещенного (Na2HP04 x 7Н20) и растворяют в дистиллированной воде до конечного объема 1000 см3. Стерилизуют 30 мин при 115° С.
Раствор 2.10 г магния сульфата (MgS04 x 7Н20), 1 г марганца хлорида (МnС12 х 4Н20), 0,135 г железа хлорного (FeCl3 x 6Н20) и 0,4 г кальция хлорида (СаС12 х Н20) растворяют в дистиллированной воде до конечного объема 1000 см3. Стерилизуют 30 мин при 115° С.
Раствор 3.5 см3 гидролизата лактальбумина (или ферментативного казеиново-дрожжевого гидролизата) растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.
Раствор 4.5 г глюкозы растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.
Раствор 5.26 г агара «Дифко» растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. Стерилизуют 30 мин при 115° С.
Приготовленные растворы асептически соединяют в следующем соотношении: раствор 1-500 см3; раствор 2-1 см3; раствор 3-20 см3; раствор 4-20 см3; раствор 5-460 см3 при 50° С.
Среда Ющенко-Дунаева. Используют для накопления иерсиний. В 990 см3 дистиллированной воды растворяют 8,5 г натрия хлорида, добавляют 3 см31/15 М раствора натрия гидрофосфата (Na2HP04 x 12Н20) и 7 см3 1/15 М раствора калия дигидрофосфата (КН2Р04). Устанавливают рН 7,2, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют 10 мин при 116° С или 30 мин текучим паром.
СБТС агар. Используют для выделения возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Выпускается в сухом виде. В 1000 см3 дистиллированной воды вносят указанное на этикетке количество сухой питательной среды и кипятят на медленном огне 5 мин. Охлаждают до 45-50° С и разливают по чашкам Петри. Готовая среда прозрачная, сине-зеленого цвета.
Среда ЭТ-1. Используют для накопления сальмонелл. К 1000 см3 МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4-7,6) добавляют 2 г глюкозы и 2 см3 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты. Смесь кипятят на водяной бане 15-20 мин, добавляют 25 000 ЕД полимиксина и асептически разливают по пробиркам. Для приготовления 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты 0,5 г розоловой кислоты растворяют в 10 см3 спирта-ректификата, после чего добавляют 90 см3 дистиллированной воды.
Среда П-1. Используют для накопления протеев. В 1000 см3 стерильного бульона Хоттингера растворяют 1 г манита, 5 г желчных солей по Олькеницкому, 0,8 г калия дигидрофосфата (КН2Р04), 20 см3 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета. Кипятят в водяной бане 15-20 мин. Добавляют 10 см3 50%-ного водного раствора мочевины и 1 000 000 ЕД полимиксина. Асептически разливают по пробиркам.
Для приготовления желчных солей по Олькеницкому к 1000 см3 бычьей или свиной желчи добавляют 40 г натрия гидроокиси и автоклавируют 3 ч при 1,5 атм. Добавляют 100 см3 20%-ного раствора бария хлорида (ВаС12 х 2Н20), автоклавируют 1 ч при 100° С и оставляют на 12-18 ч при комнатной температуре. Над осадочную жидкость сливают, фильтруют и добавляют 20%-ный раствор соляной кислоты (до кислой реакции), оставляют на 12-16 ч при комнатной температуре. После этого сливают, промывают водой и добавляют 40%-ный раствор натрия гидроокиси (до щелочной реакции). Полученный раствор солей высушивают при 115° С.
Среда К-1. Используют как селективную и для накопления клебсиелл. В 1000 см3 стерильной дистиллированной воды растворяют 5 г натрия хлорида, 0,2 г магния сульфата (MgS04 x 7Н20), 2 г калия дигидрофосфата (КН2Р04), 2 г калия гидрофосфата (К2НР04), 2 г раффинозы, 2 см3 1,6%- ного щелочного раствора бромтимолового синего, 20 см3 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета. Кипятят 15-20 мин на водяной бане, добавляют 4 см3 50%-ного раствора мочевины и асептически разливают по пробиркам.
Для приготовления 1,6%-ного щелочного раствора бромтимолового синего в 80 см3 дистиллированной воды растворяют 1,6 г бромтимолового синего, 20 см3 0,25 Н раствора натрия гидроокиси.
Среда Эндо. Селективная среда для энтеробактерий. Выпускается в сухом виде. Состоит из агара, основного фуксина, натрия сульфата, натрия фосфата, лактозы. Для посевов используют свежеприготовленную среду. В 100 см3 дистиллированной воды растворяют 5 г сухой среды, кипятят при постоянном перемешивании 2-3 мин и разливают по чашкам Петри. Для предотвращения образования большого количества конденсата среду после кипячения охлаждают до 50° С. Готовая среда имеет розовый цвет. Колонии лактозоположительных бактерий красные, лактозоотрицательных — бесцветные или слегка розоватые.
Среда Левина. Селективная среда для энтеробактерий. К 100 см3 расплавленного и охлажденного до 60-70° С 2%-ного агара Хоттингера (рН 7,2-7,4) добавляют 2 см3 0,5%-ного водного раствора ме-тиленового синего (подогретого на водяной бане до 60-70° С), 1,5 см3 2%-ного раствора эозина, 2 г лактозы и 0,2 г калия фосфорнокислого двуосновного (КН2Р04). Перемешивают, разливают по чашкам Петри и подсушивают. Перед добавлением в среду раствора красителей стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Готовая среда имеет фиолетовый цвет. Колонии эшерихий синего или черного цвета, сальмонелл — бесцветные или розовые, протея — оранжевые, с измененным цветом среды вокруг колонии.
Агар Мак-Конки (таурохолевыйагар). Селективная среда для энтеробактерий. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 20 г пептона, 5 г натрия хлорида, 2,5 г натрия таурохолата, 10 г лактозы, 0,1 г нейтрального красного, 20 г агара. Смесь стерилизуют 20 мин при 121° С.
Агар Плоскирева. Селективная среда для сальмонелл. Выпускается в сухом виде. Состоит из агара с желчными солями, натрия цитрата, натрия тиосульфата, натрия фосфата, лактозы, нейтрального красного, бриллиантового зеленого, соды кальцинированной, йода, натрия хлорида. Готовая среда прозрачная или розовато-желтого цвета. Лактозоположительные штаммы сальмонелл образуют колониии красного цвета, лактозоотрицательные штаммы — бесцветные.
Висмут-сульфит агар. Селективная среда для сальмонелл. Выпускается в сухом виде. Состоит из агара, гидролизата рыбы, глюкозы, висмута цитрата, натрия сульфита, соли Мора, натрия фосфата, бри-лиантового зеленого. Готовая среда имеет зеленоватую окраску. Штаммы сальмонелл, продуцирующие сероводород, образуют черные колони с прокрашиванием агара под колонией в черный цвет. Штаммы сальмонелл, не продуцирующие сероводород, образуют бесцветные или зеленовато-коричневые колонии.
Среда Рапопорта. Селективная среда для сальмонелл. Состав: МПБ или бульон Хоттингера — 900 см3, желчь бычья — 100 см3, глюкоза — 20 г, индикатор Андреде — 10 см3. Ингредиенты смешивают, разливают по 50 см3 во флаконы с поплавками. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.
Среда Ворфеля-Фергюсона. Используют для лучшего образования капсулы у клебсиелл. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 2 г натрия хлорида, 1 г калия сульфата (K2S04), 0,25 г магния сульфата (Mg S04 x 7H20), 20 г сахарозы, 88 см3 дрожжевого экстракта (или 2 г сухого дрожжевого экстракта), фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 121° С.
Бульон с 0,2% глюкозы. Используют для лучшего образования капсулы у клебсиелл. Берут 1000 см3 МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,2-7,4). В небольшом его объеме, нагретом до 40-50° С, растворяют 2 г глюкозы и смешивают с оставшимся бульоном. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С.
Дифференциально-диагностические среды
Среда Штерна. Используют для дифференциации сальмонелл. К 1000 см3 МПБ или бульона Хоттингера добавляют 2,5 см310%-ного насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 16,6 см310%-ного водного раствора натрия сульфита (Na2S04) и 10 см3 глицерина. Разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 112° С. Готовая среда имеет желтую окраску. Если испытуемая культура относится к S. typhimurium, которая способна ферментировать глицерин, то среда приобретает фиолетовый оттенок.
Среда Биттера. Используют для дифференциации сальмонелл. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 0,05 г пептона, 0,5 г натрия цитрата, 5 г натрия хлорида, 5 г рамнозы (или арабинозы). Кипятят на водяной бане 3-5 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С или текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Если испытуемая культура относится к сальмонеллам, способным ферментировать рамнозу или арабинозу (S. typhimurium), то при добавлении к суточной культуре (выращенной на данной среде) 2 капель 0,5%-ного спиртового раствора метилового красного среда приобретает красную окраску.
Среда для посева по Свену-Гарду. Используют для выявления у сальмонелл специфической фазы жгутикового антигена. К 1000 см3 МПБ или бульона Хоттингера добавляют 8 г агара и растворяют путем кипячения на водяной бане. Устанавливают рН 7,2-7,4, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 121° С.
Среды с аминокислотами. Используют для определения способности энтеробактерий в анаэробных условиях расщеплять левовращающие аминокислоты — лизин, орнитин, аргинин. В 600 см3 дистиллированной воды растворяют 5 г пептона и 1 г глюкозы, устанавливают рН 6,0-6,1. Приготовленный раствор разливают по 150 см3 в четыре колбы. В каждую из трех колб вносят по 10 г одной из аминокислот. Четвертая колба остается в качестве контрольной. Содержимое всех колб кипятят на водяной бане 5-10 мин, устанавливают рН 6,0-6,1. Во все че тыре колбы вносят по 0,6 см3 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезоло-вого пурпурного или бромтимолового синего и по 5 см3 0,1%-ного спиртового раствора крезолового красного. Разливают в агглютинационные пробирки по 2-3 см3 и стерилизуют 30 мин при 110° С.
Для проведения теста в пробирки, содержащие аминокислоту, и в контрольную пробирку засевают испытуемую культуру, после чего заливают стерильным вазелиновым маслом (слоем толщиной 10 мм) и инкубируют. Учет проводят в течение 4 сут. При положительной реакции среды с аминокислотами приобретают фиолетовую или синюю (в зависимости от индикатора) окраску, в контрольных пробирках среда имеет желтую окраску.
Состав 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезолового пурпурного: бромкрезоловый пурпурный — 1,6 г, спирт этиловый 96° — 100 см3.
Состав 0,1%-ного спиртового раствора крезолового красного: крезоловый красный — 0,1 г, спирт этиловый 96° — 100 см3.
Среды, содержащие органические кислоты. Используют для дифференциации сальмонелл по их способности расщеплять органические кислоты (тартраты, мукаты, натрия цитрат). В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, добавляют 8,5 см3 0,1 Н раствора натрия гидроокиси, 12 см3 0,25-ного водного раствора бромтимолового синего, 10 г D-тартрата (или одну из следующих кислот: 5 г L-тартрата, 5 г мезотартрата, 10 г муката, 10 г натрия цитрата). Устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки и стерилизуют 20 мин при 112° С. Готовая среда синезеленого цвета. При положительной реакции в процессе инкубации среда с культурой приобретает зелено-желтую окраску.
Для получения более четких результатов в конце срока инкубации в пробирки с сомнительной или отрицательной реакцией добавляют несколько капель насыщенного раствора ацетата свинца, в результате при отрицательной реакции выпадает обильный осадок (до 2/3 объема среды), при положительной — выпавший осадок незначителен.
Среда с триптофаном. Используют для определения у бактерий наличия триптофандезаминазы. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 2 г DL-триптофана. Устанавливают рН 6,7-6,9. Для определения способности бактерий к дезаминированию триптофана испытуемую агаровую культуру бактериологической петлей вносят в пробирку с 0,5 см3 раствора триптофана и инкубируют 30 мин при 37° С, после чего вносят 1 каплю 10%-ного водного раствора железа хлористого трехвалентного (FeCl3). При положительной реакции среда приобретает темно-красную окраску, при отрицательной — желтую.
Среда с калием цианидом. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 0,225 г калия дигидрофосфата (КН2Р04), 5,64 г натрия гидрофосфата (Na2HP04). Устанавливают рН 7,6, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 112° С. После стерилизации быстро охлаждают. Среду этого состава используют в качестве контрольной. Непосредственно перед применением к 100 см3 среды асептически добавляют 1,5 см3 свежеприготовленного 0,5%-ного водного раствора калия цианида (KCN), разливают по пробиркам и закрывают корковыми пробками.
Пробу считают положительной, если через 24-48 ч после посева культуры в среде заметно помутнение или опалесценция. При отрицательном результате среда остается абсолютно прозрачной, в то время как в контрольной пробирке заметно помутнение.
Среда Клиглер. Используют для определения образования сероводорода. В 1000 см3 МПБ растворяют при кипячении 20 г пептона, 5 г натрия хлорида, 0,4 г натрия сульфида, 0,08 г натрия тиосульфата, 20 г агара. Устанавливают рН 7,8, затем снова кипятят, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 0,5 г железа сернокислого, растворенного в небольшом количестве воды, 10 г лактозы, 1 г глюкозы и 12 см3 0,2%-ного раствора фенолрота в 50%-ном спирте. Среду разливают по 6-7 см3 в пробирки и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среда имеет оранжево-красную окраску. При образовании сероводорода среда окрашивается в черный цвет.
Среда Кларка. Используется для постановки реакции Фогес-Проскауэра и пробы с метиловым красным для определения окисления глюкозы с образованием 2-кетоглюконата. В 100 см3 дистиллированной воды растворяют 0,5 г калия гидрофосфата (К2НР04), 0,7 г пептона, 0,5 г глюкозы. Кипятят 2-3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,9, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 111 ° С.
Реакцией Фогес-Проскауэра выявляют промежуточный продукт расщепления глюкозы — ацетилметилкарбинол (ацетоин). Для этого испытуемую культуру выращивают на среде Кларка 4-5 дней в 2 пробирках. Одну пробирку культивируют при 25° С, другую при 37° С. Из обеих пробирок по 1 см3 культуры переносят в другие пробирки и добавляют 0,6 см3 5%-ного спиртового раствора а-нафтола, смесь перемешивают. Затем добавляют 0,2 см3.40%-ного водного раствора КОН. Тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч.
Учет реакции проводят через 15 и 60 мин. Положительная реакция — вишневое окрашивание среды.
Тестом с метиловым красным устанавливают снижение рН среды при расщеплении глюкозы до 4,4-6,0. Раствор метилового красного готовят добавлением к 0,1 г метилрота 300 см3 95%-ного этанола. После растворения красителя добавляют 200 см3 дистиллированной воды.
Для постановки теста в пробирку с 5 см3 среды Кларка вносят петлю испытуемой культуры и инкубируют 2-5 сут при 25° С. Затем добавляют 5-6 капель реактива метиловый красный и следят за изменением окраски. При положительном результате (рН 4,0-6,0) среда приобретает красный цвет. При отрицательном результате (рН 6,0-7,0) среда приобретает желтый цвет.
Среда с мочевиной по Кристенсену. Используют для определения способности бактерий к гидролизу мочевины (уреазная активность) с образованием аммиака и углекислоты. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 1 г пептона, 5 г натрия хлорида, 2 г калия дигидрофосфата (КН2Р04), 20 г агара. Смесь стерилизуют 20 мин при 115° С. Затем вносят 1 г глюкозы и 6 см3 0,2%-ного раствора фенилрота, стерилизуют текучим паром 1 ч, охлаждают до 50° С и асептически добавляют 100 см3 20%-ного водного раствора мочевины, стерилизованного фильтрацией. Среду разливают по пробиркам и скашивают.
Испытуемую культуру засевают на поверхность скошенного агара и культивируют 1-4 сут. Положительный результат (защелачивание среды) — красно-малиновое окрашивание среды.
Среда Симмонса. Используют для определения способности бактерий утилизировать цитрат как единственный источник углерода. Состав: агар — 20 г, NaCl — 5 г, MgS04 х 7Н20 — 0,2 г, К2НР04 — 1 г, NH4 х Н2Р04 — 1 г, C6H50?Na3 х 5Н20 — 3 г, бромтимоловый синий — 0,08 г, вода дистиллированная — 1000 см3.
В дистиллированной воде растворяют агар. Соли растворяют отдельно в небольшом объеме воды и затем смешивают с агаром, до объема 1000 см3. Устанавливают рН 7,2, добавляют 40 см3 0,2%-ного водного раствора бром-тимолового синего. Среду перемешивают, разливают в пробирки по 5 — 7 см3 и стерилизуют 15 мин при 121° С. После автоклавирования агар скашивают.
Испытуемую культуру засевают на поверхность агара и инкубируют. При положительном результате отмечают рост культуры на среде и изменение ее цвета с оливкового на синий.
Среда с алгинатом натрия. Используют для определения способности бактерий утилизировать натрия алгинат как единственный источник углерода. Состав среды аналогичен составу среды Симмонса, но вместо натрия цитрата вносится 2,5 г натрия алгината. Положительным считают изменение цвета среды. Микроорганизмы, не обладающие способностью усваивать натрия алгинат, на данной среде не растут.
Среды Гисса. Используют для изучения способности ферментации углеводов с образованием кислоты и газов. Состав: пептон — 10 г, натрия хлорид — 5 г, вода дистиллированная — 1000 см3,0,1%-ный индикатор Андреде, углевод 0,5% (адонит, глицерин, сорбит, дульцит, целлобиоза, раффиноза, трегалоза, салицин, арабиноза, мальтоза, рамноза, ксилоза) или 1,0% (глюкоза, лактоза, маннит, сахароза).
В дистиллированной воде растворяют навески пептона, натрия хлорида, добавляют индикатор, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,1-7,2 и стерилизуют 15 мин при 111 ° С. Затем добавляют углевод. Приготовленную среду разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 110° С.
Среда для выявления фенилаланиндезаминазы. Состав: сухой дрожжевой экстракт—3 г, натрий хлористый — 5 г, L-фенилалапин — 1 г, Na2HP04 — 1 г, агар — 12 г, вода дистиллированная — 1000 см3. Смешивают воду и дрожжевой экстракт, нагревают, добавляют компоненты и кипятят до расплавления агара, рН среды 7,0-7,2. Горячую среду фильтруют, разливают в пробирки по 2-3 см3 и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среду скашивают.
Испытуемую культуру засевают штрихом по поверхности агара и через сутки инкубации добавляют на поверхность культуры несколько капель 10%-ного водного раствора железа хлорида (FeCl3). При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет, при отрицательном результате сохраняется желтое окрашивание.
Среда для выявления β-галактозидазы. В 100 см3 расплавленного и охлажденного до 40-45° С МПА асептически добавляют 20 см3 1%-ного водного раствора О-нитрофенил-β-D-галактопиранозид. Среду разливают по пробиркам.
Испытуемую культуру засевают уколом петлей до дна пробирки. Посевы инкубируют 24 ч при 37° С.
При положительной реакции среда окрашивается в желтый цвет одним из конечных продуктов гидролиза О-нитрофенил-β-D-галактопиранозида О-нитрофенолом.
Среды для выявления лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы и чргининдегидролазы. Состав: мясная вода — 400 см3, пептон — 5 г, глюкоза — 1 г, вода дистиллированная — 600 см3, 0,1%-ный спиртовой раствор крезолового красного — 5 см3, 1,6%-ный спиртовой раствор бромкрезолового пурпурного — 0,6см3, L-лизин (или орнитин, или аргинин) —10 г.
Мясную воду, пептон, глюкозу и дистиллированную воду смешивают, устанавливают рН 6,0-6,1. Вносят аминокислоту, кипятят 8-10 мин, добавляют индикатор и разливают в агглютинационные пробирки по 3 см3. Стерилизуют 30 мин при 110° С. Цвет среды розовый.
Испытуемую культуру засевают в среды с аминокислотами (опыт) и среду безаминокислоты (контроль). Во все пробирки вносят стерильное вазелиновое иасло до получения слоя в 4-5 мм. Пробирки инкубируют 4 дня при 37° С.
При положительной реакции (защелачивание среды) наблюдается синee окрашивание в опытных пробирках и желтое — в контрольной.
Среда для определения пиразинамидазной активности у Y.enterocolitica. Состав: трипсинизированный соевый агар — 30 г, дрожжевой экстракт сухой — 3 г, пиразинкарбоксиамид — 1 г, трис-малат буфер 0,2 М, рН 6,0 — 1000 см3.
Составные части среды смешивают и подогревают на водяной бане до их растворения. Разливают по 5 см3 в пробирки, стерилизуют 30 мин при 112° С и скашивают.
Среда для определения калъцийзависимости роста у Y. еnterocolitica. В качестве питательной основы используют коммерческую среду для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (агар АГВ).
К стерильному расплавленному и охлажденному до 50° С агару добавляют (из расчета на 100 см3) 8 см3 0,25 М стерильного натрия щавелевокислого, среду тщательно перемешивают и вносят 4 см3 0,5 М стерильного раствора магния хлорида. Готовую среду разливают по чашкам Петри.
Определение индолообразования. Испытуемую культуру выращивают в пробирке с бульоном Хоттингера. В пробирку с культурой вносят 2-3 капли эфира, тщательно ее встряхивают, оставляют в покое до отстаивания на поверхности среды слоя эфира. Осторожно добавляют 0,5 см3 реактива Эрлиха, выдерживают 5 мин и учитывают результат. При наличии индолообразования слой эфира приобретает розово-красный цвет.
Для приготовления реактива Эрлиха в 95 см3 96%-ного этанола растворяют 1 г парадиметиламинобензальдегида и добавляют 20 см3 концентрированной хлористоводородной кислоты (НС1).
Лабораторная диагностика колибактериоза
Род Escherichia в настоящее время объединяет 6 видов бактерий. Практически важное для ветеринарии значение имеет один вид — Е. coli. Естественным местом обитания Е. coli является толстый отдел кишечника человека, млекопитающих животных, птиц, многих пресмыкающихся, рыб и насекомых. С испражнениями эшерихии попадают во внешнюю среду (почва, вода, пищевые продукты и др.), где могут сохраняться в течение нескольких месяцев.
Являясь представителями резидентной (постоянной) микрофлоры кишечника, эшерихии у здоровых животных старше 20-30, дневного возраста не превышают 1-2% от общей численности бактерий кишечника. Из-за особенностей становления кишечной микрофлоры у новорожденных животных первых дней жизни и до 2-3, недельного возраста число эшерихии может достиать 50% и более. Если среди них преобладают энтеропатогенные, токсигенные варианты, а животные имеют недостаточную иммунную защиту (что часто бывает у молодняка), то развиваются кишечные инфекции эшерихиозной этиологии: колибактериоз телят, поросят, ягнят, кроликов, собак, птиц; у поросят отечная форма. Транслокация эшерихий из кишечника в кровяное русло является причиной развития у разных животных септицемии, у свиноматок симптомокомплекса ММА (метрит-мастит-агалактия), у коров и других животных мастита, может стать причиной воспаления слизистых оболочек урогенитального, респираторного тракта, осложнять раневые инфекции и т.д.
Колибактериоз — остропротекающая инфекционная болезнь молодняка животных всех видов, включая птиц. Протекает в септической или энтеритной (колидиарея) формах, у поросят-отъемышей — еще и в форме энтеротоксемии (отечная форма), у птиц — в виде септицемии, реже — в виде сальпингита и колигранулематоза. Возбудителем болезни являются энтеропатогенные эшерихий вида E. coli.
Бактериологическое исследование
Материал для исследования. Свежие трупы мелких животных и птиц целиком, трубчатая кость, доля печени с желчным пузырем, селезенка, почка, сердце, перевязанное лигатурой у аорты, брыжеечные лимфоузлы, отрезок тонкого кишечника, перевязанный с двух сторон. При направлении трупов целиком в лаборатории, помимо указанного материала, исследуют еще и головной мозг.
Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, кровь.
Микроскопическое исследование исходного материала
Из поступившего материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Эшерихий являются мелкими (1,0-3,0 х 0,3-0,6 мкм) прямыми палочками. Грамотрицательные.
Выделение и идентификация культур патогенных эшерихий
Культивирование. Эшерихий — факультативные анаэробы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная температура роста 37- 38° С, рН среды 7,0-7,2, хорошо растут на всех широко используемых в лабораторной практике питательных средах.
Исследуемый материал высевают на плотные селективно-дифференциальные среды Эндо, или Левина, или Мак-Конки и среду с сорбитом. Посевы инкубируют при 37° С в течение 18-24 часов. По истечении этого срока посевы просматривают и отбирают 10 колоний (5, выросших после посева фекалий или соскобов со слизистой кишечника, и 5 - из других органов, в т.ч. брыжеечных лимфатических узлов), типичных для эшерихий, которые пересевают в МПБ, на МПА и среду Минка (при наличии колоний слизистой консистенции, т.е. тянущихся за петлей, их обязательно отсевают на среду Минка) в чашках, разделенных карандашом для стекла на 10 секторов (каждую колонию на 2 среды в отдельный пронумерованный сектор). При подозрении или целенаправленном исследовании на отечную болезнь поросят (энтеротоксемию) дополнительно пересевают несколько колоний на кровяной агар в чашке, разделенной на соответствующее количество секторов. С чашек с культурами на среде с сорбитом отсевают 3-4 колонии S-формы серовато-белого цвета в пробирки со скошенным МПА. Культуры, выделенные от птиц, на МПА и среду Минка не пересевают. Их высевают в специальные питательные среды для изучения биохимических свойств (см. ниже).
Характер роста эшерихий на питательных средах. На плотных питательных средах эшерихий образуют круглые с гладкой, вьшуклои поверхностью, ровным краем, диаметром 2-4 мм колонии. На МПА колонии полупрозрачные, сероватого цвета. На средах Эндо, Левина и Мак-Конки за счет ферментации лактозы и закисления среды приобретают цвет индикаторов: на среде Эндо - красные, малиново-красные с металлическим блеском или без него; на среде Левина — темно-синие, фиолетовые, черные с металлическим блеском или без него; на среде Мак-Конки — розовые, красные (отдельные штаммы эшерихий могут не ферментировать лактозу и формировать на перечисленных средах бесцветные колонии). На среде с сорбитом эшерихий серогруппы О157 (варианты О157:Н7 и О157:Н —), вызывающие диарею животных с признаками геморрагического гастроэнтерита, образуют серовато-белые колонии S-формы. Колонии эшерихий других серогрупп — красно-малинового цвета. Колонии штаммов, образующих гемолизин, на кровяном агаре окружены зоной гемолиза. В МПБ рост эшерихий проявляется в виде равномерного помутнения среды с образованием легко разбивающегося осадка.
Обнаруженные на данном этапе исследований эшерихий с гемолитическими свойствами, выделенные от поросят-отъемышей с признаками отечной болезни (из содержимого тонкого отдела их кишечника и (или) брыжеечных лимфатических узлов), относят к возбудителю отечной болезни (энтеротоксемии) поросят.
Морфология клеток эшерихий в культуре. Вмазках, приготовленных из культур, эшерихий обнаруживают в виде грамотрицательных, мелких (1,0-3,0x0,3-0,6 мкм) прямых палочек с закругленными концами. В поле зрения микроскопа располагаются одиночно, реже попарно. Спор не образуют. Некоторые (штаммы серо групп 08, 09, 020, 0101) образуют капсулу или микрокапсулу. Большинство подвижно за счет перетрихиальных жгутиков, но встречаются и неподвижные.
Идентификация эшерихий по ферментативным признакам. Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для эшерихий культуральными, морфологическими и тинкториальными свойствами окончательно относят к роду Escherichia и виду E.coli на основании изучения их ферментативных свойств. Ориентируясь на критерии, изложенные в табл. 94, к E.coli относят штаммы, образующие индол, не образующие H2S, дающие положительную реакцию с метиловым-красным (среда окрашивается в розово-красный цвет) и отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра (среда окрашивается в желтый цвет), не растущие на среде Симмонса, не расщепляющие мочевину, образующие лизиндекарбоксилазу. Большая часть эшерихий образует орнитиндекарбоксилазу, ферментирует манит. Все (за редким исключением) сбраживают лактозу.
На данном этапе исследований диагноз на колибактериоз считают установленным в том случае, если выделены чистые культуры Е. coli не менее чем из двух ниже указанных органов и тканей: селезенки, крови, крови сердца, костного мозга, головного мозга свежего трупа животного без изучения патогенных свойств штаммов и установления их серогрупповой принадлежности. В остальных случаях устанавливают патогенность выделенных культур.
Серологическая идентификация. Важнейшую информацию о патогенных свойствах эшерихий получают при определении их антигенной структуры. Клетки эшерихий содержат три вида антигенов: О — соматический; К — оболочечный и Н — жгутиковый.
О-антиген термостабилен (выдерживает нагревание при 100° С в течение 2,5 часов). Является липополисахаридо-протеиновым комплексом, неоднороден, и на его основе эшерихий делят на группы (более 160 О-групп).
К-антигены поверхностные, оболочечные (кислые полисахариды, редко протеины). По своим свойствам их подразделяют на три типа: L-антиген термолабильный, инактивируется при 100° С в течение часа;
В-антиген в этих же условиях теряет агглютинабелыюсть; А-антиген термостабильный, инактивируется при 120° С в течение 2,5 часов, имеется у слизистых капсулообразующих эшерихий О-групп 08,09,020,0101; Н-антиген термолабильный, инактивируется при 60° С в течение 1 часа, протеин, располагается в фимбриях (пилях), пронизывающих клеточную стенку, поэтому в последнее время его чаще называют фимбриальным антигеном.
К-антигены покрывают О-антиген и делают клетки эшерихий иннаглютинабельными в гомологичных О-сыворотках. Они обладают адгезивными свойствами, т.е. с их помощью бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам кишечника. Адгезивные антигены являются фактором патогенности, который изучается у чистых культур E.coli в первую очередь.
Н-антиген — жгутиковый, состоит из протеина, термолабилен, имеет несколько десятков разновидностей, определяемых в РА. Для диагностики существенного значения не имеет. Сочетание О-, К- и Н-антигенов характеризует серологический вариант (серовар) эшерихий.
Ведущая роль в развитии колибактериоза принадлежит эшерихиям с адгезивными антигенами К88, К99, F41, F18, 987Р, А20 и др. Наличие этих адгезинов можно выявить в реакции агглютинации на стекле или в ELISA-тесте с соответствующими антисыворотками. В нашей стране наиболее распространенным методом выявления адгезивных антигенов у эшерихий является РА. Для этой цели промышленностью выпускается набор агглютинирующих сывороток к адгезивным антигенам эшерихий. Этот набор включает моновалентные агглютинирующие сыворотки к антигенам К88, К99, F41, 987Р, А20 и поливалентную агглютинирующую сыворотку, представляющую собой смесь моновалентных сывороток в равных объемах. Сыворотки выпускаются в сухом виде во флаконах по 0,5 см3, что обеспечивает сохранение их специфической активности на срок не менее 5-ти лет.
Постановка РА. В ампулу (флакон) с сухой сывороткой добавляют растворитель (дистиллированная вода или физиологический раствор) до первоначального объема сыворотки (0,5 см3), затем растворителем разводят поливалентную сыворотку в соотношении 1:2, а моновалентные — 1:10 (рабочий титр). Разведенные сыворотки хранят в пробирках (флаконах) под резиновой пробкой при температуре 4-10° С до 3 месяцев. По внешнему виду разведенные сыворотки должны представлять собой прозрачную или слегка опалесцирующую бледно-розовую жидкость. Мутные сыворотки, проросшие плесенью или другими микроорганизмами, с обильным осадком к употреблению непригодны.
Для выявления антигенов К88,987Р и А20 используют культуры эшерихий, выращенные на МПА или агаре Хоттингера, для обнаружения антигенов К99 и F41 — на среде Минка. В обоих случаях посевы инкубируют при 37-38° С в течение 20-24 часов.
Культуры эшерихий, выделенные от птиц, для выявления адгезивных антигенов не используют.
Выросшие культуры исследуют в РА на стекле вначале с поливалентной, а затем (в случае положительной реакции) с моновалентными сыворотками. С этой целью каплю поливалентной сыворотки наносят на предметное стекло, бактериологической петлей берут испытуемую культуру и тщательно растирают с сывороткой. Реакцию учитывают в течение одной минуты при легком покачивании стекла при температуре от 18 до 28° С. Контролем служит испытуемая культура, смешанная с каплей физиологического раствора (рН 7,2 -7,4) и с каплей нормальной кроличьей сыворотки, разведенной 1:10 (для исключения самоагглютинации культуры).
Положительная реакция характеризуется склеиванием микробных клеток в зерна или хлопья различной величины и полным или частичным просветлением сыворотки при отсутствии агглютинации в контроле.
Эшерихии, давшие положительную реакцию агглютинации с одной из сывороток, считают возбудителем колибактериоза.
Наличие адгезивных антигенов у энтеропатогенных эшерихии (ЕРЕС) имеет определенную связь с хозяевами этих возбудителей и О-серогруппами.
Культуры эшерихии на скошенном МПА, полученные после пересева серовато-белых колоний со среды с сорбитом (не ферментирующие этот многоатомный спирт), исследуют с агглютинирующей коли-сывороткой О157 в РА на стекле. Реакцию ставят с живыми культурами. Для исключения самоагглютинации бактериальных клеток культуру исследуют с 0,85%-ным раствором натрия хлорида. При отсутствии агглютинации в контроле и ее наличии на стекле с коли-сывороткой О157 исследуемые эшерихии относят к возбудителю колибактериоза.