Таблица 15 - Сальмонеллы, наиболее часто выделяемые от

    животных и из продуктов животного происхождения

 

Виды животных	Сероварианты сальмонелл
Крупный рогатый скот	S. dublin, S. typhimurium, S. abortus bovis, S. enteritidis S. enteritidis
Свиньи	S. choleraesuis, S. typhisuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. dublin, S. brandenburg, S. oranienburg, S. muenster
Мелкий рогатый скот	S. abortus ovis, S. typhimurium, S. paratyphi A, S. dublin
Лошади	S. abortus equi, S. typhimurium, S. dublin
Птицы	S. gallinarum, S. pullorum, S. typhimurium
Дикие теплокровные животные, в т.ч.: грызуны; рептилии	S. typhimurium, S. enteritidis S. arizonae
Продукты животного происхождения	S. typhimurium, S. dublin, S. gallinarum, S. pullorum, S. choleraesuis, S. derby, S. infantis, S. agona,  S. panama, S. enteritidis, S. heidelberg

    

  Мазки фиксируют метиловым спиртом (5 мин) или этиловым спиртом (15 мин) ивысушивают.

Сухие препараты помещают строго горизонтально на мостики во влаж­ной камере (чашка Петри) для предупреждения высыхания сыворотки.

Сухие сыворотки в ампулах разводят стерильным физиологическим ра­створом рН — 7,4 до указанного на этикетке первоначального объема, а затем дополнительно до рабочего разведения, указанного на этикетке ам­пулы.

На каждый мазок наносят 2 капли подготовленной таким образом сыво­ротки и распределяют ее по всей поверхности мазка. Окрашивание препа­рата осуществляют 15-20 минут при комнатной температуре или в термо­стате при 37° С. Для лучшего окрашивания препараты каждые 5-7 минут слегка покачивают.

Препараты промывают физиологическим раствором рН — 7,4 в те­чение 5 минут, заменяя раствор за это время 4-5 раз. Отмытые препа­раты дополнительно отмывают дистиллированной водой и подсуши­вают.

После этого на мазок наносят небольшую каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и одной части 0,2 М фосфатного буфера рН — 8,0 и накрывают покровным стеклом. Для иммерсии используют не флуоресци­рующее масло или его заменитель, приготовленный из чистого диметилфталата (100 мл) и нафталина сублимированного (1,75 г) или тимола чис­того (5 г). Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом при увеличении 5x90 и силе тока 4,1 А.

Окрашенные флуоресцирующей сывороткой сальмонеллы имеют светящийся периферический контур (ободок). Это характерное свече­ние контура визуально оценивается в крестах: (++++) — сияющее зе­леновато-желтое свечение; (+++) — яркое желтовато-зеленоватое све­чение; (++) — умеренное желтовато-зеленоватое или беловатое свече­ние отчетливо заметного контура; (+) — слабое беловатое свечение различимого контура; (-) — клетки в виде сероватых теней, контур отсутствует или слабо заметен на отдельных участках периферии кле­ток.

  Положительным результатом считается свечение типичных для сальмо­нелл форм, оцениваемое не ниже чем в два креста, при условии, что в конт­рольных препаратах, окрашенных рабочим разведением гетерологичной сыворотки, оно оценивается отрицательно. Собственное бесконтурное све­чение некоторых бактерий всегда оценивается отрицательно, хотя оно иног­да хорошо выражено.

Для проведения исследования патологического материала и мяса готовят несколько комплектов отпечатков на стекле. После фиксиро­вания один комплект отпечатков окрашивают комплексной флуорес­цирующей сальмонеллезной сывороткой и проводят флуоресцентную микроскопию.

  Если сальмонеллы будут обнаружены хотя бы в одном из препаратов, устанавливают их принадлежность к той или иной группе. С этой целью окрашивают другие комплекты препаратов, используя раздельно, и преж­де всего те О-сыворотки, которые соответствуют сальмонеллам, наиболее часто выявляемым у животных данного вида

 

     Выявление сальмонелл серогрупп В, C_1, С_2, Д, Е экспрессным методом в реакции коагглютинации. С этой целью используют набор сальмонеллезных диагностикумов се­рогрупп В, С₁, С₂, Д, Е для реакции коагглютинации.

Для постановки реакции исследуемый материал подращивают в жидкой питательной среде (селенитовый бульон, МПБ) в течение 12-18 часов при 37° С. После подращивания культуральную среду (2-3 см³) прогревают в водяной бане при 100° С в течение 30 мин, при необходимости центрифугиру­ют или фильтруют, чтобы получить прозрачный раствор. Приготовленный таким образом материал можно хранить при 4-6° С не более 7-10 суток, в замороженном состоянии — неограниченное время.

   Сухие диагностикумы разводят дистиллированной водой в объеме, ука­занном на этикетке.

На предметное стекло, размеченное на сектора, наносят 6 отдельных капель исследуемой пробы, затем в первые 5 капель добавляют по 1 капле соответствующего диагностикума, а в последнюю — 1 каплю несенсибилизированного стафилококка (1%-ная взвесь стафилококка Cowan 1 для отрицательного контроля, который ставится с каждой пробой исследуе­мого материала). Кроме того, контролем служат: капля каждого диагно­стикума, смешанная с каплей фосфатно-солевого буфера или физиологи­ческого раствора (контроль диагностикумов на гомогенность) — на от­дельном стекле (ставится один раз в день постановки реакции); капля ди­агностикума с каплей гомологичного антигена, прилагаемого к набору (положительный контроль) — на отдельном стекле (ставится по мере не­обходимости).

    Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская их слияния, стекло помещают во влажную камеру на 30 мин при комнатной темпе­ратуре.

Результат реакции коагглютинации учитывают через 30 мин при просмотре стекол над вогнутым зеркалом, регистрируя появление агтлютинации стафило­кокков.

Положительной реакцией считается появление хлопьев агглютиниро­ванных стафилококков в одной из капель с каким-либо диагностикумом при сохранении гомогенности контрольных капель и наличии положитель­ных реакций диагностикумов с гомологичными антигенами.

Интенсивность агглютинации оценивают в крестах:

«++++» — все стафилококки склеены и легко скатываются к краю кап­ли при наклоне стекла, жидкость просветлена;

«+++» — склеена большая часть стафилококков, частичное просветле­ние жидкости;

«++» — на фоне слабого просветления жидкости четко виден агглютинат;

«+» —мелкие легкие хлопья, жидкость остается непросветленной;

«-» — признаков агглютинации нет, взвесь стафилококков гомоген­на, сходна с отрицательным контролем.

    более 7—о хранить при 4—Положительной считают реакцию с оценкой не ниже двух крестов. Положительная реакция коагглютинации свидетельствует о наличии в исследуемом материале сальмонелл соответствующей серогруппы. При не­обходимости определения серовара сальмонелл проводят бактериологи­ческие исследования с выделением чистой культуры и ее изучением, как было указано выше. При отрицательной реакции коагглютинации даль­нейшее проведение бактериологического анализа на наличие сальмонелл серогрупп В, С₁, С₂, Д, Е считается нецелесообразным.

Идентификация сальмонелл с помощью сальмонеллезного бактерио­фага. Идентификация сальмонелл может быть осуществлена с помощью сальмо­неллезного

   О-бактериофага, который высоко специфичен для этих бактерий. Он лизирует 97,5% штаммов сальмонелл и только 0,3% штаммов культур, принадлежащих к другим родам семейства кишечных (Килеско А.В., 1963; Покровский В.И., 1985 и др.). С этой целью две капли 4-или 18-часовой буль­онной культуры испытуемого штамма (можно использовать взвесь суточной агаровой культуры на физиологическом растворе) наносят тонко оттянутой пастеровской пипеткой на хорошо подсушенный МПА (рН 7,2-7,4) в чашке Петри. После подсыхания на одну из капель петлей или пастеровской пипет­кой меньшего диаметра наносят О-бактериофаг, а на другую в качестве конт­роля — каплю бульона.

Фаг наносят неразведенный или в разведении 1:5 (в зависимости от указания на этикетке). На одной чашке, таким образом, можно испытать одновременно 8-10 культур. Чашку с нанесенными культурами и О-бактериофагом помещают на 18-20 часов в термостат при 37° С, после чего учитывается результат. Положительный результат реакции при появле­нии на месте нанесения фага четко очерченной зоны сливного лизиса оце­нивают на ++++, при наличии отдельных негативных колоний, отчетли­во видимых глазом, в зависимости от их количества реакцию оценивают на +++, ++ или +.

   При отрицательном результате (отсутствие лизиса) в местах нанесения фага будет сплошной рост культуры, как в контроле.

  Культура, лизировавшаяся фагом, является подозрительной на сальмонеллезную и может быть прямо с чашки испытана в РА на стекле с полива­лентной сальмонеллезной сывороткой. В случае положительного результа­та РА культуру засевают на скошенный агар и на пестрый ряд для изучения биохимических свойств и антигенной структуры (с помощью сальмонеллезных монорецепторных сывороток), без чего не представляется возможным дать окончательный ответ о принадлежности культуры к определенному сероварианту сальмонелл. Культуры, не чувствительные к О-бактериофагу, подлежат также дальнейшему изучению (биохимическому и серологи ческому). Большую помощь О-бактериофаг может оказать при изучении атипичных, трудно диагностируемых культур. Атипичные сальмонеллезные культуры в большинстве случаев чувствительны к О-бактериофагу. Резистентными к нему могут быть некоторые штаммы S. derby, S. tennessee, S.anatum, S.london и некоторые другие, в то вре­мя как культуры, лишь сходные с сальмонеллезными по биохимическим свойствам (например, лактозонегативные E.coli), как правило, не лизируются этим фагом.

     Серологическая диагностика сальмонеллеза. Серологическая диагностика сальмонеллеза в пробирочной реакции агглютинации

Вспомогательным тестом, результаты которого учитывают в комплексе с другими диагностическими исследованиями на сальмонеллез, может слу­жить пробирочная РА, которую ставят с сыворотками, полученными от животных, подозрительных в заболевании сальмонеллезом.

Для постановки пробирочной РА отдельными наборами выпускаются серогрупповые антигены и сыворотки трех серологических групп — В, С₁ и D_l для диагностики сальмонеллеза.

Сыворотки крови животных исследуют с различными антигенами в за­висимости от вида животного, а именно: овец — с антигеном серогруппы В и, как исключение (при соответствующих бактериологических показани­ях), с антигеном D крупного рогатого скота — с антигеном серогрупп D_f и В; свиней — с антигеном всех трех серогрупп — В, С₁ и D₁

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1см³ в двух разведениях сы­воротки — 1:100 и 1:200. При исследовании с одним антигеном для каждой испытуемой сыворотки требуется три пробирки: в первую наливают 0,96 см³, во вторую и третью — по 0,5 см³ фенолизированного физиологического раствора. Затем в первую пробирку вносят 0,04 см³ испытуемой сыворотки, смешивают и переносят 0,5 см³ во вторую, из второй такое же количество в третью, из третьей 0,5 см³ удаляют.

После приготовления разведенной сыворотки во вторую и третью про­бирки вносят по 0,5 см³ антигена в рабочем разведении, указанном на эти­кетке, в первую — 0,5с м³ физиологического раствора. Разведение сыво­ротки в первой пробирке является контрольным.

Одновременно ставят контроль антигена с гомологичной серогрупповой (контрольной) сывороткой. Для этого сухую контрольную сыво­ротку разводят физиологическим раствором до объема, указанного на флаконе, и готовят двукратные разведения, начиная с 1:25 до предель­ного титра сыворотки. Во все пробирки, кроме первой, вносят по 0,5 см³ антигена в рабочем разведении, в первую пробирку — 0,5 см³ физиоло­гического раствора.

  Для контроля антигенов на самоагглютинацию к 0,5 см³ антигена в ра­бочем разведении добавляют 0,5 см³ физиологического раствора. Штативы с пробирками тщательно встряхивают до получения равно­мерной взвеси, помещают в термостат при 37-38° С на 4-10 часов, затем дополнительно выдерживают при комнатной температуре 14-20 часов, после чего производят учет реакции.

Реакцию считают: положительной — при оценке результатов на три-четыре креста в разве­дении сыворотки 1:200; сомнительной — при оценке три-четыре креста в разведении 1:100 или один-два креста в разведении 1:200; отрицательной — при оценке один-два креста в разведении 1:100 или полном отсутствии агглютинации.

Во всех случаях в контролях должны быть следующие показатели: положительная реакция с позитивной агглютинирующей сывороткой до ее предельного титра; отрицательные результаты в контрольных про­бирках с сывороткой без антигена и в контроле антигена с физиологи­ческим раствором.

От сомнительно реагирующих животных сыворотку крови исследуют повторно через 10-15 дней. Если нет повышения титра сальмонеллезных агглютининов, животных считают отрицательно реагирующими.

 

Кровекапельная реакция агглютинации (ККРА) и кровекапельная реакция непрямой гемагглютинации (ККРНГА). Данные методы исследований используют для прижизненной диагнос­тики пуллороза-тифа птиц и выявления сальмонеллоносительства у птиц.

Для постановки ККРА используют цветной пуллорный антиген. От точ­ности выполнения реакции во многом зависит результат исследований. На обезжиренное предметное стекло рекомендуется наносить 1 каплю антиге­на и примешивать к нему кровь, которую берут от исследуемой птицы из гре­бешка или подкрыльцовой вены. Для оптимального соотношения антигена и крови (примерно 5:1 соответственно) последнюю лучше примешивать пла­тиновой net лей из проволоки толщиной 0,5-0,6 мм и внутренним диамет­ром кольца 2,5-3 мм.

Предметное стекло плавно покачивают и учитывают результат в тече­ние 1-2 мин. В положительных реакциях образуются хорошо выражен­ные синеватые хлопья агглютината, а жидкость просветляется. Если об­разуется небольшое количество мелких хлопьев, то реакцию считают со­мнительной. При отрицательной реакции агглютинат не образуется и жид­кость не просветляется.

Для постановки ККРНГА используют эритропитарный диагностикум. При этом к одной капле диагностикума добавляют одну каплю крови (т.е. соотно­шение компонентов реакции должно быть близко к 1:1). Результаты реакции учитывают через 2 мин после тщательного смешивш шя эритроцитарного ан­тигена и крови при плавном покачивании предметного стекла. Образование хорошо заметных коричневатых хлопьев свидетельствует о положительной реакции, слабовыраженных мелкозернистых хлопьев — о сомнительном ре­зультате. Отрицательная реакция характеризуется стабильной гомогенной взвесью эритроцитов в капле исследуемой крови.

  Обе реакции дают лучшие результаты, если температура воздуха в по­мещении, где исследуют птицу, не ниже 16-18° С, а предметные стекла с компонентами реакции размещают на грелке-качалке М.А.Артемичева с температурой 37-42° С. При более низкой температуре и при невысоком уровне антител в крови реакцию на стекле в течение 2 мин визуально мож­но не заметить.

При необходимости реакции можно ставить пробирочным методом. Ди­агностическим титром в развернутой РНГА при исследовании сыворотки крови кур служит разведение 1:40 и выше.

Возраст цыплят, в котором удается выявить наибольшее количество но­сителей возбудителя пуллороза-тифа, 50-55 дней, индюшат — 45-50 дней. Взрослых кур исследуют в возрасте 7 мес, а индеек — в 11 мес.

 

    Лабораторная диагностика иерсиниозов

 

Род Yersinia согласно «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology» (1994) объединяет 11 видов: Y. pestis; Y. pseudotuberculosis; Y. enterocolitica; Y. kristensenii; Y. intermedia; Y. frederiksenii; Y. aldovae; Y. rohdei; Y. mollaretii; Y. bercovieri; Y. ruckeri. Из них зоопатогенными видами являются: Y.pestis — возбудитель чумы, острого инфекционного заболевания животных и чело­века, относящегося к группе особо опасных инфекций; Y. pseudotu­berculosis — возбудитель псевдотуберкулеза животных; Y. enterocolitica — возбудитель иерсиниоза животных и человека; Y. ruckeri — возбудитель «красного рта» радужной форели и других видов рыб, остановимся на диагностике иерсиниоза и псев­дотуберкулеза.

 

      Иерсиниоз - инфекционная болезнь многих видов животных и человека, характеризующаяся у молодняка животных гастроэнтероколитами с развити­ем диареи (фекалии нередко с примесью крови), которая может перемежаться с запорами. Реже могут наблюдаться артриты, конъюнктивиты, дерматиты и бронхопневмония. У коров могут наблюдаться маститы, эндометриты, рожде­ние нежизнеспособного приплода, энтериты. У кроликов болезнь протекает в виде эпизоотии с высокой летальностью. При этом у больных животных отме­чают анорексию, прогрессирующее истощение, субфебрильную температуру и последующий смертельный исход. Широко распространено длительное бак­терионосительство. У человека кроме диареи возможно развитие псевдоап­пендицита, мезентериалыюго лимфаденита, артритов, менингита, гепатита, поражения сетчатки, сепсиса, сопровождающегося высоким уровнем смерт­ности.

Возбудителем болезни является Y.enterocolitica. Эти бактерии выделе­ны практически от всех видов млекопитающих, птиц, рыб, земноводных, моллюсков, насекомых. Они обнаружены в воде, почве, сточных водах, пищевых продуктах, включая овощи и фрукты. Широкой распространен­ности иерсиний способствуют их психрофильные свойства (способность размножаться и накапливаться в различных питательных субстратах при 4° С).

 

  Псевдотуберкулез — инфекционная болезнь многих видов животных и че­ловека, характеризующаяся преимущественно латентным течением, мезентериальным лимфаденитом, длительным расстройством деятельности желудоч­но-кишечного тракта. Возможно развитие тяжелой септицемии. У лошадей может наблюдаться пневмония и сильное обезвоживание на фоне диареи. У крупного рогатого скота наблюдают пневмонию, аборты и маститы. Аборты и маститы при псевдотуберкулезе могут быть у овец и коз. У кроликов болезнь возможна в острой, подострой и хронической формах. У птиц отмечают ост­рую форму заболевания с развитием поносов, одышки, истощением, взъерошенностью шерсти, потемнением кожных покровов. У собак и кошек псевдо­туберкулез чаще всего начинается остро без заметного продромального пери­ода. Появляются лихорадка, угнетение, анорексия, диарея, рвота, боль в мыш­цах при пальпации. В ряде случаев отмечают кашель, а также признаки пора­жения печени (желтушное окрашивание склер, темный цвет мочи). Нередко клинические признаки кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза оказыва­ются весьма сходными.

У людей различают кишечную, скарлатиноподобную, артритную фор­мы течения псевдотуберкулеза. Нередко болезнь протекает с поражением печени и напоминает болезнь Боткина. Возможно развитие септической формы, особенно у детей, пожилых и ослабленных лиц.

  Возбудителем болезни является Y. pseudotuberculosis, выделяемая от млекопитающих, птиц, пресмыкающихся, земноводных, членистоногих и рыб.

Принципиальные схемы лабораторной диагностики кишечного иерсини­оза и псевдотуберкулеза сходны и потому ниже излагаются совместно.

Лабораторная диагностика иерсиниозов основана на результатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой и люминесцентной микроскопии, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.

 

     Бактериологическое исследование

     Материал для исследования. Свежие трупы мелких животных и птиц целиком, трубчатая кость, доля печени с желчным пузырем, селезенка, почка, отрезки тонкого и толстого отделов кишечника, перевязанные с двух сторон, мезентериальные и под­челюстные лимфоузлы, корень языка, миндалины.

С целью прижизненной диагностики используют фекалии. При наличии в фекалиях примеси крови, слизи, гноя, пленок для исследования отбирают именно такие пробы. Наибольшие шансы на выделение возбудителя име­ются, если материал отбирают в период острого течения болезни при повы­шенной температуре тела.

 

    Микроскопическое исследование исходного материала. Из поступившего материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Иерсиний являются грамотрицательными прямыми палочками с закругленными концами, иногда имеют вид коккобактерий. Диаметр клеток 0,5-0,8 мкм, длина от 0,8-1,2 до 2,0-3,0 мкм.

        

  Выделение и идентификация культур иерсиний

Культивирование. Возбудители псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза являются фа­культативными анаэробами, обладающими и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Хемоорганотрофы. Оптимальная температура куль­тивирования 22-28° С, но размножаться они способны при температурах от 2 до 40° С. Диапазон рН 6,0-9,0, оптимальная величина рН 7,4-7,6.

  Иерсиний хорошо растут на дезоксихолатном агаре, средах Мак-Кон­ки, Эндо, Серова, СБТС. Среда Плоскирева и висмут-сульфит агар обла­дают выраженным ингибирующим действием на иерсиний обоих видов. Оба возбудителя способны расти на голодных средах (голодно-кислый агар, фосфатно-буферный раствор и др.).

Высеву исследуемого материала на питательные среды обычно предше­ствует его обогащение, позволяющее повысить эффективность выделения культур иерсиний.

   Общепризнанным методом обогащения материала при исследованиях на иерсиниозы является метод холодового обогащения, основанный на спо­собности иерсиний размножаться в питательных субстратах при низких плю­совых температурах. Большинство других микроорганизмов, включая и энтеробактерии иных родов, такой способностью не обладает. Способность Y.enterocolitica u Y.pseudotuberculosis расти на голодных средах и исполь­зование в силу этого фосфатно-буферного раствора в качестве среды обо­гащения, придают методу дополнительную эффективность.

Исследуемый материал массой не менее 20 г растирают в ступках. Из­мельченные пробы вносят в пробирки со стерильной средой обогащения (фосфатно-буферный раствор) в соотношении 1:5. Пробирки помещают в холодильник при температуре 4° С. Начиная со вторых-третьих суток хра­нения из пробирок начинают делать ежедневно (до получения положитель­ных результатов, но не более 15 суток хранения) высевы на среду Эндо или среду с индикатором бромтимоловым синим (СБТС), являющуюся диффе­ренциально-диагностической для выделения возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза.

Существенным недостатком классического метода холодового обога­щения является его длительность (до 15 суток), из-за чего бактериологичес­кие исследования в ряде случаев затягиваются до 28 суток. Устранить этот недостаток позволяют рекомендуемые для выделения и идентификации чи­стой культуры Y. enterocolitica экспресс-методы, предусматривающие ис­пользование «холодового удара», «теплового удара» и «щелочной обра­ботки».

  При применении метода «холодового удара» пробирки с исследуемым материалом помещают в холодильную камеру при температуре минус 18° С на 18 часов. Затем материал оттаивают и делают из него высевы на среды Эндо или СБТС.

При использовании метода «теплового удара» пробирки с исследуемым материалом помещают в термостат при 42° С на 18 часов. После этого про­изводят посевы на среды Эндо или СБТС.

Для метода «щелочной обработки» предварительно готовят 40%-ный раствор едкого кали на стерильной дистиллированной воде и хранят его в холодильнике. Перед проведением исследований из 40%-ного раство­ра готовят 0,5%-ный раствор едкого кали на стерильном 0,5%-ном ра­створе натрия хлорида. Для этого в стерильных условиях смешивают 7,9 мл 0,5%-ного раствора натрия хлорида с 0,1 мл 40%-ного раствора едкого кали.

Приготовленный таким образом раствор щелочи разливают по 0,2 мл в лунки полистироловой пластины и вносят в них 0,2 мл исследуемого мате­риала в среде обогащения. Смесь тщательно перемешивают. Выдержива­ют в течение 3-5 мин и делают высевы в бульон Хоттингера. Посевы инку­бируют при 37° С в течение суток и делают из них высевы в чашки со среда­ми Эндо или СБТС.

Помимо фосфатно-буферного раствора в качестве сред обогащения могут быть использованы буферно-казеиново-дрожжевая среда, 1%-ная забуферная пептонная вода, 1%-ная пептонная вода с добавлением К₂НРО₄.

  Исследуемый материал с жидких сред обогащения высевают на среду Эндо или СБТС петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают. Посевы инкубиру­ют при 22-25° С в течение 18-24 час (на СБТС — в течение 48 час). По истечении этого срока посевы просматривают и характерные для иерсиний колонии пересевают на слабощелочной МПА или агар Хоттингера. Посе­вы инкубируют при 22-25° С в течение суток. Из типичных изолирован­ных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Из тех же колоний делают высевы на питательный бульон для определения оксидазной активности. Посевы инкубируют при 22-25° С в течение су­ток. В бульонные культуры добавляют 0,2 мл оснафтола и 0,3 мл диметилпарафенилендиамина, содержимое пробирок перемешивают. При наличии оксидазы в течение 30 сек происходит окрашивание бульона в фиолетовый цвет. Дальнейшему изучению подлежат только грамотрицательные, не об­разующие оксидазу культуры (сем. Enterobacteriaceae). Такие культуры высевают на среду Клиглера и среду с мочевиной по Кристенсену. Для дальнейшего изучения отбирают культуры, не образующие сероводород (оранжево-красный цвет среды Клиглера не изменяется в черный после 24 час инкубирования посевов), обладающие уреазной активностью (красно-ма­линовое окрашивание среды Кристенсена в течение 1-4 суток инкубиро­вания посевов).

 

Характер роста иерсиний на питательных средах. На плотных питательных средах при 4-28° С оба возбудителя в аэробных условиях образуют колонии S-формы. На агаре Хоттингера и МПА через 18-24 часа образуются круглые с ровными краями, полупрозрач­ные, блестящие колонии с голубоватым оттенком, мягкой консистенцией и диаметром 0,5-1,0 мм. На агаре Эндо колонии круглые, выпуклые, блес­тящие с ровными краями, бесцветные со слегка розоватым оттенком, диа­метром от 0,1 до 1,0 мм.

На СБТС агаре через 48 часов на сине-голубом фоне среды образуются голубые колонии с фестончатым краем, выпуклым центром и суховатой матовой поверхностью, диаметром 1,5-2,0 мм. При взятии петлей они сдви­гаются по поверхности агара. Иногда (особенно у возбудителя псевдоту­беркулеза) виден светло-голубой ободок по краю колонии. Колонии дру­гих энтеробактерий, не разлагающих мочевину (эшерихии, сальмонеллы и др.), изменяют окраску среды, приобретая желтый цвет и характерную мор­фологию (сочные, выпуклые). В жидких средах (МПБ, бульон Хоттингера) образуют равномерное помутнение.

При температурах культивирования свыше 28° С микроорганизмы обо­их видов диссоциируют в R-форму. При этом на плотных питательных средах, наряду с описанными выше колониями S-формы, появляются ко­лонии с выраженным полиморфизмом по размеру, форме, цвету (особенно при температуре 37° С и выше). Чаще всего R-формы колоний имеют буг ристую поверхность, неправильную форму, неровные изрезанные края, коричнево-желтоватый цвет. Нередко они имеют суховатую консистен­цию. В жидких средах R-формы образуют помутнение и хлопьевидный осадок либо осадок и рыхлую поверхностную пленку с прозрачной надо-садочной жидкостью.

 

  Морфология иерсиний в культуре. В мазках из культур возбудители обоих видов представляют собой грамотрицательные овоидные палочки или коккобактерии размером 0,5- 0,8x1,0-3,0 мкм. Спор и капсул не образуют. Y. enterocolitica чаще распо­лагается в мазках поодиночно, но может образовывать и цепочки различ­ной длинны. Y. pseudotuberculosis цепочки образует чаще, а также может окрашиваться биполярно.

   Иерсиний обоих видов подвижны при температуре ниже 30° С (подвиж­ность выражена максимально при 20-22° С) за счет перитрихиально рас­положенных жгутиков и неподвижны при 37° С. У Y. enterocolitica подвиж­ность обычно выражена в большей степени, чем у Y. pseudotuberculosis.

 

  Идентификация иерсиний по ферментативным признакам. Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для иер­синий культуральными, морфологическими и тинкториальными свойства­ми относят к роду Yersinia на основании изучения их ферментативных свойств. К иерсиниям относят штаммы микроорганизмов, не об­ладающие оксидазной активностью, не образующие сероводород, уреазопозитивные, дающие положительную реакцию с метиловым-красным, от­рицательную реакцию Фогес-Проскауэра (при 37° С), не растущие на сре­де Симмонса, не образующие лизиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, подвижные при 4-28° С и неподвижные при 37-42° С, не ферменти­рующие лактозу и ферментирующие с образованием кислоты маниит, L-арабинозу. Ни Y. pseudotuberculosis, ни Y. enterocolitica не растут в при­сутствии KCN.При дифференциации Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis следует иметь в виду, что Y. pseudotuberculosis не ферментирует лактозу, сахаро­зу, раффинозу, целлобиозу, дульцит, инозит, сорбит, инулин и D-арабинозу, но ферментируют с образованием кислоты глюкозу, галактозу, L-арабинозу, левулезу, маннозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, трегалозу, маинит и салицин; редуцируют нитраты, метиловый синий; вступают в реакцию с метиловым красным; образуют каталазу; обладают уреаз-ной активностью; не образуют ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауера при температурах 25 и 37° С.

   Y. enterocolitica не ферментируют лактозу (есть лактозоположительные варианты, часто среди сероваров 05 и 07,8), рамнозу, раффинозу; не обла­дают фенилаланиндезаминазой, лизиндекарбоксилазой и аргининдегидролазой. Реакция Фогес-Проскауэра положительная при температуре 25° С и отрицательная при 37° С.

Другие 8 видов рода Yersinia, а именно: Y. aldovae, Y. kristensenii, Y. frederiksenii, Y. rohdei, Y. mollaretii, Y. bercovieri, Y. intermedia, Yruckeri мо­гут находиться в испражнениях людей, животных и в смывах с предметов ок­ружающей среды. Они так же, как Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis хоро­шо растут на питательных средах для выделения иерсиний. Тесты, позволяю­щие дифференцировать Y. pseudotuberculosis, 5 биоваров Y. enterocolitica от других часто встречающихся видов иерсиний, представлены в таблице 16.

Таблица 16 - Основные биохимические свойства

Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, отличающие их от других

видов рода Yersinia

 

Тест		Y. enterocolitica					Y. frederi ksenii	Y. inter­media	Y.kris tensenii	Y. aldo-vae
	Y.pseudotuberculo­sis	Биовары
		I	I I	III	IV	V
Лактоза 37° С	-	+	-	-	-	-	d	d	-	-
Мальтоза 37° С	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-
Сахароза 37° С	-	+	+	+	+	d	+	+	-	-
Фогес-Проскауер 37° С	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Фогес-Проскауер 25° С	-	+	+	+	+	+	+	+	-	+
Рамноза 25° С	+	-	-	-	-	-	+	+	-	+
Цитрат Сим­монса 37° С	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Цитрат  Сим­монса 25° С	-	-	-	-	-	-	d	-	-	d
Индол	-	+	+	-	-	-	+	+	d	-
Ксилоза 37° С	+	+	+	+	-	-	+	+	d	d
Салицин 37° С	d	+	-	-	-	-	+	+	d	-
Сорбит 37° С	-	+	+	+	+	-	+	+	+	+
Трегалоза 37° С	+	+	+	+	+	-	+	+	+	-

Обозначения:«+»— признак положительный; «—» — признак отрицательный; «d» — признак варьирует у различных штаммов.

 

Возбудитель псевдотуберкулеза по ряду свойств сходен с возбудите­лем чумы (Y. pestis) и в ряде случаев, главным образом при исследовании материала от грызунов (особенно в природных очагах чумы), когда посе­вы из органов производят непосредственно на плотные питательные среды, может возникнуть необходимость дифференциации этих возбудите­лей. Основные отличительные признаки Y. pseudotuberculosis и Y. pestis представлены в таблице 17.

Таблица 17 - Свойства и дифференциация Y.pestis и Y.pseudotuberculosis

 

Тест или свойство	Реакция
	Y. pestis	Y. pscudotubcrculosis
Подвижность при 37° С	-	-
Подвижность при 25° С	-	+
Гидролиз мочевины	-	+
Ферментация адонита	-	+
Ферментация L-рамнозы	-	+
Ферментация мслибиозы	-	+
Чувствительность к фагу при 37° С	+	d
Чувствительность к фагу при 25° С	+	-
Реакция с антисывороткой к фракции 1 Y.pestis	+	-
Продукция коагулазы	+	-
Продукция фибринолизина	+	-
Патогснность для мышей	+	+
Патогснность для белых крыс	+	-
Патогснность для морских свинок	+	+
Патогснность для кроликов	-	-

  

Наиболее ценными для дифференциации этих возбудителей являются тесты, характеризующие их отношение к мочевине, подвижность, наличие фибринолизина и плазмокоагулазы. Кроме того, следует учитывать непри­хотливость к питательным средам Y.pseudotuberculosis и отсутствие поли­морфизма у колоний Y.pestis, который обычно растет на специальных сре­дах, и при 28° С на вторые сутки образует колонии только R-формы. При подозрении на выделение Y.pestis дальнейшую идентификацию проводят в специализированных учреждениях.

  Культуры, отнесенные к видам Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis, подвергают серологической идентификации в реакции агглютинации на стекле. Завершающим этапом является определение патогенных свойств выделенных штаммов иерсиний.

 

Серологическая индикация и идентификация иерсиний. Y.enterocolitica имеют соматический (О) и жгутиковый (Н) антигены. У вирулентных штаммов обнаруживаются V- и W-антигены, расположенные в наружной мембране клетки. У отдельных штаммов имеется антиген К1, связанный с фимбриями и разрушающийся только автоклавированием при 120° С в течение часа (Ющенко Г.В., 1985).

О-антигены возбудителя кишечного иерсиниоза являются полисахари­дами, устойчивыми к нагреванию и действию этанола. Согласно классифи­кации Winbland—Wauters по О-антигену различают более 60 сероваров Y.enterocolitica, которые обозначают арабскими цифрами 1,2 и т.д. Часть сероваров имеет разделение на субсеровары, обозначаемые буквами a, b и т.д. Также буквами обозначают и жгутиковый термолабильный антиген, разрушающийся при кипячении.

Наиболее распространенными среди животных и людей являются серова­ры: Ol, 2a,3; 02a, 2b,3; 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 06,31; 07,8; 08; 09; О10; 013,7; 014; 015; 018; 019,8; О20; 021 и 022.

Y.enterocolitica серовара О3 распространены на всех континентах. Ча­стота их обнаружения на территории России составляет от 15 до 60% и более. Далее следуют серовары 04,32 и 05,27 (10-50%), 07,8 (5-10%) и 09 (1-30%). Другие из названных сероваров встречаются значительно реже.

Y.pseudotuberculosis имеют жгутиковый антиген (Н), 2 соматических (О) антигена S и R, антигены вирулентности — V и W, расположенные в наруж­ной мембране и выраженные при температуре культивирования иерсиний 37° С. Н-антиген образуется при температуре 18-20° С, термолабилен и не имеет диагностического значения. R-антиген является общим для всех псев­дотуберкулезных бактерий, а также и для Y.pestis. Обнаружена общность этого антигена с сальмонеллами групп В и D. По S-антигену различают 8 сероваров Y.pseudotuberculosis, обозначаемых римскими цифрами (I-VIII). Большая часть штаммов, выделенных на территории России, как и в дру­гих странах, от животных, человека, из объектов внешней среды, относит­ся к серовару I (60-90%). На втором месте по частоте обнаружения нахо­дится серовар III (10-30%). Серовары II, IV, V обнаруживают в 2-8% случаев. О циркуляции в нашей стране Y.pseudotuberculosis сероваров VI, VII и VIIIсведений нет.

   Антигенные связи Y.pseudotuberculosis и большинства сероваров Y. enterocolitica слабые и выявляются лишь иммунно-диффузионными мето­дами. Более значительные антигенные взаимодействия, проявляющиеся в традиционной РА, имеют место у возбудителя псевдотуберкулеза серовара I с культурами Y.enterocolitica сероваров 08; 018 и 021.

Оба возбудителя имеют общий антиген с энтеробактериями других видов, за счет чего могут быть получены положительные реакции с сы­воротками к некоторым представителям этого семейства. У Y.pseudotuberculosis установлены антигенные связи с сальмонеллами шигеллами и эшерихиями, у Y.enterocolitica — с сальмонеллами, проте­ями, серрациями, гафниями, клебсиеллами. Особо следует отметить на­личие антигенного родства у серовара 09 с представителями рода Brucella. 

В связи с этим в благополучных по бруцеллезу хозяйствах не­редко выявляются неспецифические реакции с бруцеллезным диагностикумом, обусловленные инфицированием крупного рогатого скота Y.enterocolitica. Возбудитель кишечного иерсиниоза имеет антигенное родство с холерным вибрионом и возбудите­лем туляремии. С Y.pestis близкие антигенные связи и постоянные перекрестные положи­тельные результаты реакций имеет возбудитель псевдотуберкулеза. Y.enterocolitica не имеет антигенных связей с Y.pestis.

Серологической идентификации подлежат культуры, отнесенные по био­химическим свойствам к видам Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с диагностическими сыворотками к наиболее распространенным сероварам иерсиний. Наборы, выпускаемые для этих целей (Санкт-Петербургский институт им. Пастера), включают сыворотку, поливалентную к I-V сероварам, и сыворотки, моновалентные к I и III сероварам Y.pseudotuberculosis, а также сыворотки к сероварам: 03; 04,32; 04,33; 05,27; 05; 06,30; 07,8; 08; 09 и 013,7 Y.enterocolitica.

Реакция агглютинации ставится по общепринятой методике. С этой целью из флакона пастеровской пипеткой набирают сыворотку, не захва­тывая при этом осадка со дна флакона. Каплю сыворотки наносят на пред­метное стекло и тщательно растирают в ней петлю 20-24-часовой агаро­вой культуры испытуемого штамма. После получения гомогенной суспен­зии стекло покачивают осторожными круговыми движениями. Положи­тельная реакция (агглютинация) наступает сразу или не позднее 2-3 мин в виде склеивания бактериальной массы с образованием плотных, с тру­дом разбивающихся зернышек. Жидкость при этом полностью или час­тично просветляется.

  При отрицательной реакции смесь сыворотки и бактериальной массы остается в виде равномерной гомогенной взвеси.

   В последние годы разработан и успешно апробирован ряд методов ди­агностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, направленных на обнаружение возбудителей или их антигенов в патологическом материале от павших животных, а также в копрофильтратах и моче больных живот­ных с подозрением на псевдотуберкулез и иерсиниоз.

 

   Иммуноферментный анализ (ИФА). В последнее десятилетие установлена прямая зависимость между степе­нью выраженности вирулентных свойств Y.pseudotuberculosis и концентра­цией антигенов вирулентности в наружней мембране. Показано, что для реализации адгезии возбудителя к эпителию слизистой оболочки кишечни­ка с последующей инвазией и размножением в эпителии и макрофагах необ­ходима экспрессия белков наружной мембраны (БНМ) — антигенов виру­лентности. Данное обстоятельство делает перспективным использование БНМ с диагностическими целями.

В настоящее время разработано и апробировано 3 варианта тест-систем для ИФА, направленного на обнаружение БНМ иерсиний:

   ИФА-ЛПС — псевдотуберкулезная система с широким спектром при­менения как для диагностики псевдотуберкулеза, так и для решения эпиде­миологических вопросов. Чувствительность метода —10⁵ микробных кле­ток в 1 см³ пробы, что соответствует 100 мкг/мл липополисахарида возбу­дителя. Эффективность метода 70,2-81,1%;

     ИФА-БНМ-1 — тест-система для ранней диагностики псевдотубер­кулеза. Обладает строгой специфичностью и позволяет выявлять воз­будителя в органах и тканях животных, копрофильтратах и моче. Она наиболее эффективна при исследовании материала в начальный пери­од болезни, когда антигены обнаруживают в 69-84% проб копрофиль-тратов и в 21-38% проб мочи. Чувствительность метода 10^s-5х10⁵ микробных клеток в 1 см³;

   ИФА-БНМ-П — тест-система для выявления антигенов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в материалах от больных (копрофильтраты, моча), павших и вынужденно убитых животных.

Для определения видовой принадлежности выявленных иерсиний (анти­генов возбудителя) пробы, давшие положительную реакцию в тест-системе ИФА-БНМ-П, проверяют в тест-системе ИФА-ЛПС для выявления возбу­дителя (антигенов) псевдотуберкулеза.

Чувствительность метода — 10⁵ микробных клеток в 1 см³, эффектив­ность — до 83,6% положительных проб при исследовании копрофильтра-тов в первые 5 дней болезни. На пике инфекционного процесса данным методом выявляют до 70% инфицированных животных.

   Для исследования материала в тест-системе ИФА-БНМ-П копрофильтраты, выпот брюшной полости вносят в фосфатно-буферную или буферно-казеиново-дрожжевую среду в количестве 1 г на 5 см³ среды для подращи­вания при температуре 3-7° С. Внутренние органы и ткани растирают с этими средами в ступке (соотношение 1:5). Образцы исследуют в первые сутки получения проб и затем на 3-5-е сутки от начала подращивания. Мочу исследуют в нативном виде.

Результаты учитывают визуально или спектрофотометрически. В пер­вом случае реакцию оценивают в крестах по интенсивности появляющего­ся коричневого окрашивания в лунках. Положительной считают реакцию с пробой, которая дала реакцию не менее чем на ++, и по интенсивности окраски существенно отличается от проб отрицательного контроля (К -, оцененные как «—» или «+»). Положительные результаты должны быть и в пробе с положительным контролем (К +).

  При спектрофотометрическом учете результатов содержимое лунок с отрицательным контрольным образцом (К-) используют в качестве нуле­вого контроля. Измерение оптической плотности проводят при длине вол­ны 450 нм и считают результат положительным, если коэффициент погло­щения светового потока исследуемого образца достигает величины не ме­нее 0,05.

Наборы компонентов для постановки всех трех вариантов ИФА разра­ботаны Санкт-Петербургским институтом эпидемиологии и микробиоло­гии им. Пастера. Каждый из компонентов рассчитан на проведение 192 анализов, включая контроли.

  Реакция коагглютинации (РКА). Для постановки РКА пробы мочи и копрофильтратов (с подращиванием и без него) прогревают в водяной бане в течение 30-40 мин, центрифугиру­ют, фильтруют и исследуют надосадочную жидкость. Сыворотку крови ис­следуют в нативном состоянии.

На предметное стекло, разделенное на необходимое число секторов, наносят капли исследуемого материала. В каждую из капель исследуемого образца добавляют по 1 капле коагглютинирующих диагностикумов раз­личных видов и сероваров иерсиний, в последнюю каплю вносят взвесь несенсибилизированных стафилококков (отрицательный контроль). В ка­честве положительного контроля на отдельном предметном стекле смеши­вают по 1 капле каждого использованного диагностикума с 1 каплей липополисахарида соответствующих бактерий в концентрации 10-20 мкг/см³. Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская сли­яния проб, расположенных рядом. Результат реакции учитывают через 5-30 минут экспозиции стекол во влажной камере по образованию хлопьев агглютината стафилококков и просветлению жидкости.

  РКА наиболее эффективна в начальный период острого заболевания (1-5-й дни), при других формах — в сроки максимальной выраженности клинических признаков.

По данным различных авторов чувствительность данного мето­да исследований составляет 10⁵-10⁸ микробных клеток/см³. Эффек­тивность при кишечном иерсиниозе — до 85%, при псевдотуберку­лезе — до 60-70% в первые 5 дней от начала болезни. В отличие от РА при постановке РКА не наблюдается перекрестных реакций с другими представителями энтеробактерий, бруцеллами. Использо­вание РКА сокращает сроки исследования на иерсиниоз с 14-17 до 3-4 суток в сравнении с традиционным бактериологическим иссле­дованием.

 

Реакция латекс-агглютинации (РИА). РИА используют для выявления антигенов возбудителей псевдотубер­кулеза и кишечного иерсиниоза в копрофильтратах и в смывах с объектов внешней среды. В отличие от РКА, в качестве носителей иммуноглобули­нов используют частицы латекса, которые не обладают антигенностью, а потому предпочтительнее стафилококка. Латексный псевдотуберкулезный диагностикум выпускается Санкт-Петербургским НИИ вакцин и сыворо­ток. Сконструированы латексные диагностикумы и для индикации Y.enterocolitica сероваров О3; О5, 30; О7,8.

Чувствительность метода — 10⁶ микробных клеток в 1 см³ исследуемой пробы. Диагноз на псевдотуберкулез данным методом может быть подтвер­жден у 73% больных животных.

Большинство штаммов Y.enterocolitica, выделяемых на территории Рос­сийской Федерации от животных, человека и из объектов внешней среды, относятся к сероварам О3; О9; О5, 27; О8; О6, 30. В Европе преобладают бактерии сероваров О3 и О9, в США — О8, на Дальнем Востоке — О6.

   В многочисленных работах, посвященных изучению иерсиниозов у жи­вотных, сообщается, что практически на всех территориях от свиней изоли­руют Y.enterocolitica сероваров О3; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 07; 08; 09; 011;012;017 и 019,а иерсиний, выделенные от крупного рогатого скота, относятся к сероварам О3; 04; 05,27; 07,8; 012; 013 и 018.

 

       Определение патогенности Y.pseudotuberculosis являются безусловно патогенными микроорганиз­мами. У них, в отличие от Y.enterocolitica, отсутствует зависимость виру­лентности от наличия плазмиды, контролирующей синтез V- и W-антигенов и кальцийзависимость роста, поскольку бесплазмидные варианты сохраня­ют инвазивные и цитотоксические свойства. Это указывает на определяю­щую роль хромосомного контроля основных патогенных свойств Y.pseudotuberculosis. Поэтому выделение чистой культуры, отнесение ее к виду Y.pseudotuberculosis и определенному его серовару являются доста­точными основаниями для постановки диагноза на псевдотуберкулез. Од­нако и в этом случае иногда прибегают к постановке биопробы. С этой целью ставят кератоконъюнктивальную пробу (тест Шереня) на морских свинках. При этом в один из конъюнктивальных мешков животного инокулируют каплю суспензии испытуемого штамма концентрацией 10¹⁰ микроб­ных тел. При положительном результате в течение 48-72 час развивается гиперемия конъюнктивы, отек век и сужение глазной щели, наблюдают серозно-гнойное истечение.

Возможно использование для постановки биопробы и белых мышей, ко­торых заражают орально, внутривенно или внутрибрюшинно. В зависимо­сти от метода инокуляции псевдотуберкулезного возбудителя, животные погибают на 3 -9-е сутки. На вскрытии обнаруживают увеличение печени и селезенки, которые имеют многочисленные некротические очажки, напо­минающие туберкулезные бугорки, но в отличие от них, не подвергающие­ся обызвествлению. Аналогичные абсцессы или узелки обнаруживают и в легких.

К безусловно патогенным Y.enterocolitica относятся бактерии сероваров 03; 04, 32; 05; 05, 27; 06, 30; 07,8; 08; 09 биоваров IIи IV, реже I и III.Наряду с ними выделяется и значительная часть апатогенных иерсиний. При этом принадлежность того или иного штамма к опреде­ленному серологическому и биологическому варианту далеко не всегда подтверждает либо опровергает его этиологическую значимость. Име­ется достаточно сообщений о выделении патогенных штаммов иерсиний серо-биоваров, ранее считавшихся непатогенными, и наоборот. Из-за столь неоднозначной роли различных серобиоваров Y.enterocolitica в патологии животных для правильного решения вопроса о патогенности того или иного штамма, а следовательно, и для правильной постановки диагноза необходимы дополнительные исследования его факторов вирулентности.

Для большинства патогенных штаммов Y. enterocolitica характерны вы­раженные адгезивные свойства, обусловливающие колонизацию возбуди­теля на энтероцитах, а также энтеротоксигенность. Продуцируемый возбу­дителем в больших количествах термостабильный энтеротоксин весьма сходен с таковым энтеротоксигенных неинвазивных эшерихий.

Механизм действия термостабильного энтеротоксина Y.enterocolitica связан с активацией аденилатциклазы в эпителиальных клетках кишечни­ка, что ведет к накоплению циклического гуанозинмонофосфата и наруше­нию водноэлектролитного баланса и энтеросорбции. В реализации дей­ствия энтеротоксина принимают участие и простоглаидины. Наблюдаемая при этом колонизация энтероцитов при минимальной инвазии или ее отсут­ствии подтверждает важную роль энтеротоксина в патогенезе кишечного иерсиниоза. Энтеротоксигенные Y.enterocolitica вызывают у животных и человека диареи различной интенсивности.

Штаммы Y.enterocolitica, обладающие инвазивностью, способностью размножаться в органах и тканях организма хозяина, вызывают генерализованную инфекцию. Корреляции между эптеротоксигенностью и инвазив­ностью у данного возбудителя не установлено.

В отличие от Y.enterocolitica, у Y.pseudotuberculosis установлены мак­симальная инвазивность, цитотоксичиость и способность к генерализа­ции инфекции. Действие энтеротоксина Y.pseudotuberculosis на слизис­тую оболочку кишечника выражено значительно меньше, чем у Y. enter ocolitica.

К настоящему времени установлено, что к возбудителю кишечного иер­синиоза чувствительны некоторые лабораторные животные.

  Rokovsky (1973) сообщает, что гибель морских свинок наблюдается при внутрибрюшном их заражении патогенными иерсиниями в дозе 3х10⁹ мик­робных клеток в течение 24-48 часов. К подкожному введению возбуди­теля животные оказались устойчивы.

   А.Б. Дайтерун и соавт. (1987) удалось вызвать у морских свинок конъ­юнктивит, а в ряде случаев абортивный кератит при введении патогенных иерсиний серовара 09 в конъюнктивальную полость. При этом штаммы серовара ОЗ патологической реакции не вызвали.

В опытах Lee et al. (1980) показано, что пероральное заражение кроль­чат (массой 1,0-1,3 кг) или взрослых особей (массой 2,0-3,0 кг) ведет к развитию профузной диареи и последующей гибели животных. Для зараже­ния использовали адгезивный, но неинвазивный штамм серовара О3. Ин­фицирующая доза составляла 2,9x10⁸ микробных клеток.

Многие авторы сообщают о чувствительности к пато­генным иерсиниям белых мышей.

Лучшими способами заражения являются внутрибрюшное и подкожное введение бактерий. При этих способах аппликации иерсиний в разных опы­тах и для различных сероваров (О3; 08; 09; 06,30) ЛД₅₀ возбудителя со­ставляли от 1,5х10⁷ до 2,5х10⁸ микробных клеток.

   При пероральном заражении мышей инфекционный процесс удавалось воспроизвести только при искусственном подавлении иммунитета (бестимусные животные, обработка иммунодепрессантами) либо на мышах-гнотобиотах.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что патогенность Y.enterocolitica для лабораторных животных изучена еще недостаточно. До­полнительную сложность в изучении данного вопроса вызывает циркуляция в природе патогенных иерсиний с различной степенью вирулентности для жи­вотных, включая и лабораторных. Вследствие этого нередко при заражении патогенными иерсиниями лабораторных животных их гибели не наблюдается, поэтому биопроба для проверки патогенности Y. enterocolitica не рекомендует­ся.

Выше упоминалось о том, что патогенность у Y.enterocolitica детерми­нируется плазмидой и сопровождается наличием у таких штаммов ряда культуральных особенностей, которые предложено использовать в качестве мар­керов вирулентности.

 

   Определение способности к аутоагглютинации. Феномен аутоагглютинации проявляется при культивировании в жид­кой питательной среде и заключается в спонтанном склеивании клеток иерсиний. Для проверки данной способности в две пробирки со средой Кларка засевают чистую культуру испытуемого штамма Y.enterocolitica, получен­ную на МПА. Посевной материал вносят в количестве 10⁶-10⁸ микробных клеток в объеме 1 см³. Одну из пробирок инкубируют при температуре 37° С, вторую — при 25° С в течение 24-48 часов.

Патогенные иерсинии при температуре культивирования 37° С образу­ют обильный хлопьевидный осадок, а при 25° С — равномерное помутне­ние, при этом возможен небольшой, компактный осадок.

Непатогенные бактерии в обеих пробирках дают рост в виде равномер­ного помутнения при отсутствии хлопьев.

При длительном лабораторном хранении штаммов с частыми пересева­ми и культивированием при 37° С часть изначально патогенных клеток, составляющих популяцию изучаемого штамма, может утрачивать плазмиду, отвечающую за вирулентность. При наличии в популяции 30-70% та­ких бесплазмидных клеток результаты теста становятся нечеткими. В та­ких случаях его повторяют после предварительного клонирования с целью выделения плазмидосодержащих клонов. Данную операцию можно осуще­ствить при определении кальцийзависимости роста изучаемого штамма, что также относится к одному из маркеров вирулентности у данного вида бактерий.

  Определение кальцийзависимости роста. Данный тест основан на том, что у патогенных иерсинии при культиви­ровании их на кальцийдефицитной агаровой среде при температуре 37° С проявляется ограничение роста. Это выражается образованием колоний значительно меньшего диаметра, чем при культивировании на обычных питательных средах или при дефиците ионов Са ++, но при температуре 25° С.

Для определения кальцийзависимости готовят специальную кальцийдефицитную среду на основе коммерческого агара АГВ. На поверхность этой среды в двух чашках Петри засевают культуру испытуемого штамма, выра­щенную в среде Кларка при 25° С. Посев ведут с тем расчетом, чтобы полу­чить рост изолированных колоний (от 100 до 500 клеток на стандартную чашку Петри). Одну чашку инкубируют при 37° С, вторую — при 25° С в течение 48 часов, после чего учитывают результаты теста.

Патогенные иерсинии при 37° С вырастают в виде колоний значитель­но меньшего диаметра, чем на чашке, инкубировавшейся при 25° С. Иногда рост может отсутствовать вовсе. Дополнительное инкубирование та­кой чашки при 25° С в течение 24-48 часов ведет к образованию коло­ний обычного размера.

Непатогенные иерсинии при обеих температурах образуют колонии обычной величины (через 24 часа диаметром 1,0-1,5 мм, через 48 часов — до 1,5-2,0 мм).

При наличии в популяции патогенных иерсинии клеток, утративших плазмиду, детерминирующую факторы патогенности, рост при 37° С отме­чают в виде различного соотношения крупных и мелких колоний.

 

   Определение температурозависимой морфологии колоний. Морфологию колоний иерсинии изучают после их 24-48-часового ин­кубирования при 25° С и 37° С на агаре АГВ в чашках Петри.

Учет результатов осуществляют невооруженным глазом или с помощью лупы. Диаметр колоний измеряют окуляр-микрометром.

При 37° С патогенные иерсинии образуют малопрозрачные, желтовато­го цвета, зернистые, выпуклые колонии, диаметр которых, как правило, не превышает 1,0 мм.

При 25° С колонии патогенных штаммов сходны по морфологии и размерам с колониями, образуемыми непатогенными иерсиниями при обеих температурах инкубирования. Они более прозрачны, голубова­того цвета, плоские, маслянистой консистенции, имеют диаметр в 1,5- 3 раза больший, чем у патогенных иерсинии, вырастающих при 37° С.

 

Определение пиразинамидазной активности. Тест основан на способности непатогенных Y.enterocolitica продуцировать пиразинамидазу и отсутствии такой способности у патогенных штаммов.

Для выполнения теста готовят специальную плотную питательную сре­ду с пиразинкарбоксиамидом. В пробирку со скошенной питательной сре­дой высевают культуру испытуемого штамма и инкубируют посевы в тече­ние 48 часов при 25-30° С. По окончании инкубирования на поверхность среды с выросшими колониями наносят 1%-ный водный свежеприготовлен­ный раствор железистого сульфата аммония. Учет результатов теста про­водят через 15 минут.

  Колонии непатогенных иерсинии, продуцирующих пиразинамидазу, при­обретают розовую окраску, патогенных — не изменяют своего цвета.

 

  Серологическая идентификация вирулентных иерсинии в реакции агглютинации на стекле (РА-СВИ). Вирулентные иерсинии выявляют с помощью диагностической сыворот­ки к вирулентным иерсиниям (СВИ) в РА на стекле.

Комплект для РА с сывороткой диагностической к вирулентным иер­синиям (СВИ) содержит СВИ с рабочим разведением 1:10 и 10 %-ную нормальную кроличью сыворотку («К-» для контроля специфичнос­ти).

Для постановки реакции на обезжиренное предметное стекло наносят 1 каплю СВИ и 1 каплю «К -». В обе капли добавляют по одной петле куль­туры испытуемого штамма, выращенной на МПА при 25-37° С, и расти­рают биомассу до образования гомогенной суспензии. Затем стекло осто­рожно покачивают, наблюдая за результатом реакции.

Положительная РА вирулентных иерсиний с СВИ характеризуется по­явлением крошек агглютината в течение 3 минут. Агглютинат лучше заме­тен на темном фоне при косом освещении. В суспензии с нормальной сыво­роткой («К-») агглютинат образовываться не должен.

При отрицательной реакции в обеих каплях сохраняется равномерная, гомогенная суспензия бактерий.

Серологическая диагностика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза

    Реакция агглютинации. РА с набором типовых штаммов (живых и убитых культур) в настоящее время получила широкое применение в результате использования стандартных антигенов. Для по­становки РА используют стандартные иерсиниозные антигены, представ­ляющие собой суспензию инактивированных формалином культур эталон­ных штаммов Y.enterocolitica сероваров 03; 04,32; 04,33; 05; 05,27; 06,30; 07,8; 09 и Y.pseudotuberculosis сероваров I и III концентрацией 10 млрд. микробных клеток в 1 см³. Перед постановкой реакции, которую осуще­ствляют методом равных объемов, антигены разводят до рабочей концент­рации 1 млрд./см³ (1:10).

При кишечном иерсиниозе характер гуморального иммунного ответа в значительной степени зависит от тяжести и клинического проявления бо­лезни. Высокие титры антител обнаруживаются при тяжелом поражении суставов и септической форме инфекции. При легком течении, особенно при гастроэнтероколитах, антитела выявляют в более низких титрах, од­нако и в этом случае их уровень часто достигает диагностических величин. Выше упоминалось о наличии у иерсиний общих внутриродовых антигенов и антигенов, обуславливающих перекрестные реакции с рядом энтеробак-терий других родов, бруцеллами. Однако на пике инфекционного процесса уровень видо-серовароспецифических антител, как правило, значительно превышает уровень гетерологичных антител. Этим обусловлен минималь­ный диагностический титр в РА, равный 1:160-1:200. Лучше использо­вать метод парных сывороток крови, при котором достоверным считается 2-4-кратное и более нарастание титров антител. Антитела к Y.enterocolitica начинают выявляться со 2-й недели болезни.

К антигенам антитела в крови появляются уже к концу первой недели болезни, а существенное увеличение титров (1:200 и более) отмечают к на­чалу 3-й недели. Этими сроками определяется необходимость использо­вания, как и при кишечном иерсиниозе, метода парных сывороток при по­становке РА. Через 2 месяца наблюдается снижение концентрации антител, и к 6 месяцам их титры обычно не превышают значений 1:50-1:100.

  Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)