Методы культив-я вирусов. Заражение жив-х, куриных эмбрионов. Получение культур. Среды. Цитопатич эффект, проявления. Р-я гемадсорбции

Вирусы размнож-ся только в жив клетках. Культив-е вируса происходит на уровне орг-ма подопытн жив-го и на уровне культуры клеток (вне орг-ма). Вирусы имеют тканевую и типову специф-ть. Поэтому при выдел-и неизвестного вируса одномоментно заражают 3-4 культуры клеток. Чаще используют эмбрион/ткани (кур/эмбрион). Вирусы оспы хорошо размнож-ся в хорион-аллантоисной оболочке, паротита – в амнионе, гриппа – в амнионе и аллантоисе, бешенства – в желточном мешке. Берут 12-дневные эмбрионы.

При невозмож-ти выделить и идентиф-ть вирус стандартными методами (на культуре клеток, кур/эмбрионах) инфекц материал вводят лаборат жив-м (мыши, кролики, обезьяны), после развития инфекц процесса проводят повторное зараж-е чувствит клеточных культур. Методы типирования вирусов:

микроскопические – вирусоскопия, обнаруж-е внутриклеточных включ-й;

иммуновирусологич – метод иммунной электронной микроскопии, иммунофлюоресценции, гемагглютинации, гемадсорбции.

Идентиф-я вирусов – иммуновирусологич методы, включают р-и – РТГА, задержки гемадсорбции, РСК, РН, преципитации в геле агара.

Цитопатич эффект - индикатором наличия вирусов в заражённой культуре клеток служат:

· Развитие специфич дегенерации клеток – под микроскопом: образ-е многоядерных гигантских клеток, округление клеток, очаги клеточной пролиферации.

· Обнаруж-е внутриклет включ-й – в цитоплазме или ядре (окрашивают, смотрят под микроскопом).

· Обнаруж-е специфического Аг методом иммунофлюоресценции.

· (+) р-я гемадсорбции, (+) р-я гемагглютинации.

· Образ-е бляшек – появл-ся обесцвеч участки в культуре, состоящие из погибших клеток – это колонии вируса. Окрашивают красным красителем – бляшки круглые, светлые.

Р-я гемадсорбции – вирусы адсорбируют вносимые в культуру клеток эритроциты (позволяет судить о репродукции вирусов).

Особ-ти размнож-я вирусов с 1-нитью ДНК. Репликативная и промежут репликативные формы. Особ-ти размнож-я вирусов с 1-нитью РНК.

Особ-ти репликации вирусов с 1 нитью ДНК: это – IV стадия репродукции вирусов: синтез вир/белков и реплик-я нуклеин к-т. У ДНК-вирусов вначале транскрибир-ся «ранние» гены, контрол-ют образ-е вирусспецифич ДНК-полимеразы (при участии РНК-полимеразы хозяина). Образ-ся «ранняя» вирусная и-РНК, она транслир-ся на рибосомы клетки, где синтез-ся ДНК-полимераза. С её помощью происходит реплик-я вирусной ДНК, образ-ся «фонд» ДНК, кот-й использ-ся для сборки вир/частиц. Этот процесс происходит в ядре (у поксвирусов – в цитоплазме).

Особ-ти реплик-и вирусов с 1 нитью РНК: это – IV стадия репродукции вирусов: синтез вир/белков и репликация нуклеин к-т. В 2 этапа: сначала матрица, потом – копия с этой матрицы. У РНК-вирусов репликация идёт по 3-м путям:

· РНК пикорнавирусов выполняет роль и-РНК, транслир-ся на рибосомы, служит матрицей для образ-я гигантского полипептида. Он расщепл-ся на несколько белков, 1 из кот-х - полимераза.  Нач-ся репликация той же РНК, освобождённой от рибосом.

· РНК др вирусов служит матрицей, на кот-й транскрибир-ся и-РНК. Она транслир-ся на рибосомы, образ-ся определённые вир/белки, 1 из кот-х - полимераза. Далее - репликация вирусной РНК, причём вначале образ-ся форма из 2-х нитей.

· У онкогенных РНК-вирусов синтез идёт иначе. С матрицы РНК образ-ся ДНК-копия, имеющая 1 нить ДНК. В этом процессе участвует обратная транскриптаза, кот-я есть в вирионе. Затем идёт репликация этой нити ДНК, образ-ся 2 нити. На матрице этой ДНК-копии синтез-ся молекулы РНК.

Процесс включ-я РНК вируса в хромосому клетки нач-ся с синтеза ДНК-копии генома вируса при участии вирионного фермента полимеразы. Происходит наращ-е 2-й спирали, после чего концы обеих нитей соед-ся друг с другом, замыкая молекулу ДНК в кольцо. Образовавшаяся вирусная ДНК встраив-ся в клеточную ДНК при участии 2-х вирионных ферментов: эндонуклеазы (разрезает нити ДНК) и полинуклеотидлигазы (сшивает нити ДНК). При этом транскрипция интегрированного в хромосому генома вируса может вызвать злокач трансформацию ткани.

Р-я гемагглютинации, мех-м у вирусов гриппа. Р-я торможения гемагглютинации, применение.

Р-я гемагглютинации – основана на способ-ти вирусного гемагглютинина вызывать агглютинацию эритроцитов жив-х. Проходит в 2 стадии: I – адсорбция вирионов на эритроците в рез-те взаимод-я их гликопротеидных рецепторов; II – агглютинация эритроцитов, нагруженных вирусами; видна глазом. Для вируса гриппа хар-на спонтанная диссоциация смеси, кот-я приводит к освоб-ю вируса. Это происходит в рез-те гидролиза рецепторного мукоида эритроцита и освоб-я вируса за счет содержащейся в его внешней оболочке нейраминидазы. Гемагглютинин вируса гриппа содерж-ся в суперкапсиде в гликопротеинов шипах, кот-е пронизывают липидный бислой. Гемагглютинин обусл-ет проникн-е вирусов в клетки в рез-те слияния с мембраной клетки и мембранами лизосом. АТ к нему обеспечивают защитный эффект.

Мех-м РТГА: опред-ют видовую принадлеж-ть вирусов. Основана на способности антисыв-ки подавлять вирусную гемагглютинацию, т.к.нейтрализованный вирус не агглютинирует эритроциты.