2020-06-30
713
Цель работы: Ознакомиться с методами получения накопительных и чистых культур микроорганизмов. Освоить технику посева микроорганизмов на плотные и жидкие питательные среды и методики выделения чистых и накопительных культур из различных объектов окружающей среды. Научиться описывать культуральные свойства микроорганизмов.
Оборудование: микроскопы, спиртовки, бактериологические петли, препарировальные иглы, пипетки, предметные и покровные стекла, капельницы с водой, фильтровальная бумага.
Порядок выполнения работы:
1. Приготовление препаратов.
Для микроскопирования бактерий и дрожжей наносят на чистое предметное стекло каплю исследуемой культуры и покровным стеклом размазывают каплю по поверхности предметного стекла. Затем покровное стекло опускают на смоченную поверхность предметного стекла, избыток жидкости удаляют с помощью фильтровальной бумаги.
Для микроскопирования микроскопических грибов кусочек грибницы переносят в каплю воды, нанесенную на предметное стекло. Сверху накрывают покровным стеклом. Избыток жидкости убирают кусочками фильтровальной бумаги.
2. Изучение морфологии.
Рассмотреть под микроскопом и зарисовать: форму клеток бактерий, форму и расположение клеток дрожжей, строение грибницы и органов размножения микроскопических грибов.
3. Написать отчет о проделанной работе.
Контрольные вопросы.
1. Что такое «чистые культуры» микроорганизмов и для чего их выделяют из объектов окружающей среды?
2. В чем заключается сущность биологических методов выделения чистых культур патогенных микроорганизмов?
3. По каКОС признакам описывают культуральные свойства микроорганизмов, выросших на плотных средах в чашках Петри?
4. Перечислите основные этапы пересева микроорганизмов из пробирки.
Лабораторная работа № 3
Осуществление микробиологического контроля пищевого производства. Изучение результатов санитарно-бактериологического анализа проб воды, воздуха, смывов с рук.
Бактериальное загрязнение определяют путем изучения микрофлоры смывов, сделанных с рук и поверхностей исследуемых объектов.
Смывы с оборудования и инвентаря производят перед началом работы либо после санитарной обработки в санитарные дни.
Смывы с рук следует производить перед началом работы, после пользования туалетом. Взятие смывов с рук персонала, спецодежды, инвентаря и оборудования производят с помощью стерильных ватных тампонов на стеклянных (лучше металлических) палочках или марлевых салфеточек размером 5 х 5 см, завернутых в бумажные пакеты.
Непосредственно перед взятием смыва увлажняют тампон или салфетку стерильной 0,1 %-ной пептонной водой или физиологичесКОС раствором, предварительно разлитым по 2 мл в стерильные пробирки. Салфетки при этом захватывают прокаленным пинцетом. После взятия смыва тампон или салфетку помещают в ту же пробирку, из которой проводили увлажнение. При контроле жирных поверхностей пользуются сухими тампонами или салфетками.
Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности в 100 см2 в разных местах исследуемого предмета. Для ограничения поверхности используют шаблон (трафарет) площадью 25 см2.
При взятии смывов с рук протирают тампоном ладони обеих рук, проводя не менее 5 раз по одной ладони и пальцам, затем протирают участки между пальцами, ногти и под ногтями.
При взятии смывов с санитарной одежды протирают 4 площадки по 25 см2: нижнюю часть каждого рукава и две площадки с верхней и передней части спецовки.
Смывы исследуют на обнаружение бактерий группы кишечной палочки и определение наличия коагулазоположительных стафилококков.
Приборы и посуда: термостат, чашки Петри, ватные тампоны или салфетки, пипетка.
Материалы и реактивы: мясо-пептонный агар, изотонический раствор хлорида натрия.
Порядок выполнения работы
Материалом для посева при исследовании смывов является смывная жидкость, используемая для увлажнения тампона или марлевой салфетки.
1. Определение общего числа микробов.
К 2 мл изотонического раствора хлорида натрия, используемого для увлажнения тампона, прибавить еще 8 мл.
Тампон тщательно отмыть, встряхивая. Полученное исходное разведение 1: 10 внести в чашки Петри по 1 мл, залить расплавленным, и остуженным до 45 °С мясо-пептонным агаром.
Чашки Петри поместить в термостат, где поддерживается температура 37 °С, на 48 ч.
По истечении этого времени подсчитать количество выросших колоний.
2. Выявление коагулазоположительных стафилококков.
Для этого производят посев непосредственно тампоном на чашки с молочно-солевым агаром. Если смывы делают марлевыми салфетками, то посев на плотные питательные среды удобнее осуществлять нанесением на поверхность среды в количестве 0,1 мл смывной жидкости, которую затем тщательно растирают шпателем по всей поверхности агара.
В качестве среды накопления для стафилококков применяют питательный бульон с 6,5,%. хлорида натрия, разлитый по 5 мл в пробирки, куда помещают оставшуюся смывную жидкость.
3. Выявление наличия бактерий кишечной группы. Для этого посев произвести в среду накопления, для чего тампон, которым производили ранее посев на молочно-солевой агар (или марлевую салфетку), погрузить в среду Кесслера, разлитую в пробирки по 5— 10 мл.
Дальнейший ход исследования на обнаружение стафилококков и бактерий группы кишечных палочек производят, как указано в п. 1.
Бактерии группы кишечной палочки и коагулазоположительных стафилококков должны отсутствовать в смывах с контролируемых объектов.
4. Написать отчет о проделанной работе.
Санитарно-бактериологический анализ воды
Приборы и посуда: чашки Петри, водяная баня, стерильная пипетка, пробирки, термостат, лупа.
Материалы и реактивы: питательная среда на агаре.
Порядок выполнения работы
Отбор пробы.
Для отбора проб воды используют стерильные флаконы вместимостью 0,5 л с пробкой. Проба должна быть исследована не позднее чем через 2 ч после отбора.
2. Определение общего числа бактерий в воде. Сущность метода заключается в определении в 1 мл воды общего содержания мезофильных, мезотрофных аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательной агаризованной среде данного состава при температуре 37±0,5°С в течение 24±2 ч, при этом образовывать колонии, видимые при увеличении в 2— 5 раз. Питательную среду расплавляют в водяной бане и охлаждают до температуры 45±5°С.
Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и пишут на крышках номер пробы, дату посева и объем посеянной воды.
Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух различных объемов, выбранных с таКОС расчетом, чтобы на чашках Петри выросло от 30 до 3000 колоний. При исследовании водопроводной воды засевают в каждую из двух чашек по 1 мл.
С флаконов с пробами снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фломбируют (держат несколько секунд над пламенем), после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку. Стерильной пипеткой отбирают соответствующие объемы воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.
Для посева 0,1 мл и меньших объемов воды используют разведения анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9 мл стерильной воды вносят 1 мл анализируемой воды. При этом пипетка должна быть опущена ниже поверхности воды не более чем на 3 мм, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 мл и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1 мл анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды этой же пипеткой переносят 1 мл содержимого первой пробирки в следующую, с 9 мл стерильной воды. Посев 1 мл из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,01 мл анализируемой воды и т. д.
После внесения воды в чашку Петри ее заливают 10—12 мл остывшей питательной среды при фламбировании краев посуды со средой. Воду быстро смешивают с питательной средой, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды. Затем чашки с посевами помещают в термостат вверх дном не более чем по 4 чашки вместе. Посевы выращивают при 37±0,5°С в течение 24 ч.
Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с увеличением в 2—5 раз или прибора1 для счета колоний. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. Для большей точности каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна специальной тушью или чернилами. Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При посеве 1 мл неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие 300.
Если в чашке1 с наиболее высоКОС разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, допускается подсчитывать колонии при помощи пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадь в 1 см2 каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое числа колоний, приходящихся на 1 см2. Эту величину умножают на площадь чашки S (в см2), вычисленную по формуле S = πR2.
Результаты подсчета колоний в каждой чашке выражают числом бактерий в 1 мл анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательный результат принимают среднее арифметическое результата подсчета на двух параллельных чашках или разных разведений. Результат округляют следующим образом: если результат находится в пределах чисел от 1 до 100, записывают те числа, которые получены; если результат находится в пределах от 101 до 1000, округляют до 10; если результат находится в пределах чисел от 1001 до 10000, округляют до 100 и т. д.
Число колоний учитывают, ориентируясь на одну чашку в следующих случаях: если на другой чашке при посеве из разведения выросло не менее 20 колоний; при ползучем росте бактерий, распространившемся на всю поверхность чашки или занимающем значительные зоны и маскирующимся ростом других колоний; при количестве колоний свыше 300. Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете числа колоний, когда на обеих чашках отмечен ползучий рост. При этом подсчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки.
