Исследование химических свойств мочи

1. рН.

В норме рН мочи обычно слабокислая, но может иметь разную реакцию (4,5-8) [9]. Стойкий сдвиг реакции мочи в сторону кислой или щелочной реакции является неблагоприятным патогенетическим фактором. Реакцию мочи следует учитывать при проведении химического, микроскопического и бактериологического исследований мочи и при назначении больному диуретиков и антибактериальных средств [8].

Принцип методы: реакция мочи определяется с помощью универсального индикатора или смеси индикаторов. При длительном хранении образца значение pH мочи увеличивается, моча становится более щелочной из-за контакта с воздухом и увеличения числа бактерий. На результаты реакции влияют дезинфицирующие и моющие средства [7];

2. Глюкоза. Общепринятыми методами не определяется 0,03–0,15 г/л, поэтому при оценке результатов исследования мочи считается, что в норме глюкоза в моче отсутствует.

Качественные методы. Исторически первыми были разработаны химические методы, основанные на восстановлении ионов меди глюкозой: на способности альдегидной группы глюкозы при нагревании восстанавливать различные соединения и менять цвет раствора. К ним относятся пробы Фелинга, Бенедикта, Ниландера, Гайнеса, Троммера и ряд других. Однако они не обладают большой специфичностью, поскольку многие компоненты мочи (физиологические и патологические), а также отдельные лекарственные препараты обладают восстанавливающими свойствами.

Проба Гайнеса. Принцип основан на восстановлении глюкозой при нагревании в щелочной среде ионов меди Cu²⁺ (синего цвета) в Cu¹⁺ (красно-оранжевого цвета).

Ход определения: в пробирку вместимостью 10 мл вносят 3-4 мл мочи, добавляют 5-10 капель реактива Гайнеса, перемешивают и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 5 минут, оценивают результат: в присутствии глюкозы появляется зеленая, желтая, оранжевая или кирпичная окраска; синий цвет указывает на отсутствие глюкозы в моче.

Полуколичественная оценка проводится помощью тест-полосок. В данном случае метод основан на реакции между глюкозооксидазой, глюкозой и хромогеном. Глюкоза при участии фермента глюкозоксидазы превращается в глюконовую кислоту с образованием перекиси водорода, которая в присутствии пероксидазы окисляет индикатор с образованием окрашенного соединения. Цвет реакционной полоски зависит от используемого индикатора.

Любое изменение цвета аналитической зоны тест полоски расценивается как положительный результат (качественное определение).

При использовании тест-полосок следует иметь в виду, что методы, основанные на глюкозооксидазной реакции, более чувствительны к водным растворам глюкозы, чем к глюкозе в моче, в связи с эти они завышают результаты определения глюкозы в разведенной моче по сравнению с более концентрированной. 

Количественное определение глюкозы в моче, как правило, не проводится, так как наиболее широко применяется метод с использованием тест-полосок. При этом в случае необходимости возможно количественное определение глюкозы в моче методами, которыми исследуется глюкоза в биохимических исследованиях крови: гексокиназный, глюкозооксидазный, о-толуидиновый [9].  

3. Белок.

У здоровых людей белок в моче отсутствует или его концентрация менее 0,002 г/л. Появление белка в моче называется протеинурией.

Все качественные пробы на белок в моче основаны на способности белков подвергаться денатурации под влиянием различных физических и химических факторов. При наличии белка в исследуемом образце мочи появляется либо помутнение, либо выпадение хлопьевидного осадка. В то же время ни один из большого числа качественных методов определения белка в моче не позволяет получить надежные и воспроизводимые результаты [7].

Одним из первых качественных методов была кольцевая проба Геллера с концентрированной азотной кислотой. В настоящее время ее не используют, поскольку она является недостаточно воспроизводимой, трудоемкой и длительной процедурой, требующей концентрированной азотной кислоты.

Проба с сульфосалициловой кислотой (200 г/л) представляет собой чувствительный и наиболее простой в исполнении метод. При смешивании сульфосалициловой кислоты с небольшим объемом мочи рН смеси снижается до 1-2, при этих значениях рН белки образуют с анионом сульфосалицилата нерастворимые комплексы. Пробу с сульфосалициловой кислотой считают наиболее подходящей для выявления патологической протеинурии [6].

Ход определения:

1) в две пробирки, опытную и контрольную (холостая проба), вместимостью 10 мл, вносят по 1,0-2,0 мл профильтрованной или центрифугированной мочи;

2) в опытную пробирку добавляют 2-3 капли 200 г/л раствора сульфосалициловой кислоты;

3) на темном фоне сравнивают прозрачность опытной и контрольной проб;

4) оценивают результат: помутнение в пробирке с опытной пробой указывает на наличие белка в пробе мочи.

Избыток раствора сульфосалициловой кислоты приводит к растворению белка.

Полуколичественные методы основаны на модификации пробы Геллера с азотной кислотой и более известны как метод Брандберга-Робертса-Стольникова. Концентрацию белка в моче этим методом определяли путем разведения образца мочи до тех пор, пока при очередном ее наслаивании на раствор азотной кислоты (500 г/л) или реактив Ларионовой (азотная кислота - 10 г/л в насыщенном растворе хлорида натрия) кольцо на границе фаз образуется в промежутке между 2-й и 3-й минутами. Если кольцо появляется раньше 2 мин, мочу разводят в 2 раза и снова повторяют исследование. Если и на этот раз кольцо появляется раньше 2 мин, мочу снова разводят в 2, 4, 8 и т. д. раз, пока тонкое белое кольцо не появится на 2-3-й минуте. При расчете концентрации белка в исходном образце мочи пользовались расчетными таблицами, либо значение 0,033 г/л умножали на степень разведения. В настоящее время данный метод находит ограниченное применение и представляет лишь исторический интерес [9].

Широкое применение получил метод полуколичественной оценки протеинурии с помощью диагностических тест-полосок.

Метод основан на способности белковых растворов изменять цвет индикатора бромфенолового синего. В растворе со значением рН ˂5 индикатор находится преимущественно в катионной форме (желтая окраска). При добавлении в раствор индикатора меняется соотношение между катионной и анионной формами индикатора в пользу анионной, имеющей синюю окраску. Цвет раствора в зависимости от концентрации белка меняется от желтого до зеленого и синего. Основной предпосылкой получения надежных результатов является поддержание значений рН в пределах 3,0-3,5 в ходе реакции. Изменение цвета от желтого до синего свидетельствует о присутствии белка. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка, присутствующего в моче.

Все известные современные методы количественного определения содержания белка в моче основаны на образовании окрашенных комплексов с различными соединениями, интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка и измеряется фотометрически на различных биохимических анализаторах.

В клинико-диагностических лабораториях наиболее популярными оказались два красителя, обладающих свойствами индикатора: пирогаллоловый красный (ПКГ) и бромфеноловый синий (БФС). Наиболее применяемым является метод с ПГК, который постепенно вытесняет все другие методы. Особу популярность метод получил после оптимизации условий реакции и состава инкубационной среды. При предложенной прописи реактивов образующийся комплекс краситель-белок обладает максимальным светопоглощением при 600 нм. Связывание в кислой среде (рН 2,5) белками комплекса «ПГК-ионы молибдена» сдвигает максимум светопоглощения с 400 до 600 нм, что позволяет проводить количественное определение белка в моче в широком диапазоне концентраций [9].

Использование специализированного фотометра превращает определение концентрации белка в моче методом с ПГК в рутинную лабораторную процедуру. С практической точки зрения анализатор «Белур 600» (рисунок 6) позволяет решить проблему определения концентрации белка в моче в небольших лабораториях.

Рисунок 6

При температуре 37^оС длительность реакции между белком и красителем составляет 10 минут. Образующийся комплекс устойчив к воздействию многих соединений, в том числе лекарственных препаратов, солей, оснований и кислот.

4. Кетоновые тела. Общепринятыми методами не определяется (меньше 50 мг/сут). Кетонурия - появление кетоновых тел в моче. К кетоновым телам относятся 3 соединения: ацетон, ацетоуксусная кислота и β-оксимасляная кислота. Большая часть жиров и некоторые белки способствуют образованию кетоновых тел. Кетоновые тела быстро окисляются в тканях до углекислого газа и воды, поэтому с мочой за сутки выводится около 20-50 мг кетоновых тел. Кетонурия может быть следствием повышенного образования кетоновых тел и следствием нарушения их распада.

В большинстве лабораторий проводят только качественное и полуколичественное (с помощью тест-полосок) определение кетоновых тел в моче. Количественная оценка, как правило, не проводится.

Проба Легаля. Реактивы: свежеприготовленный 5% водный раствор нитропруссида натрия, 10-15% раствор гидроксида натрия, уксусная кислота ледяная.

Ход определения: к 5-6 мл мочи прибавляют несколько капель нитропруссида натрия и 0,5 мл щелочи. Получается красное окрашивание. Добавляют 0,5-1 мл уксусной кислоты. Если красный цвет исчезает, проба отрицательная, если сохраняется - положительная. Если получается слабо-розовая окраска, то проба считается также положительной.

Проба Лестраде. Это определение кетоновых тел в моче с помощью сухого реактива (или таблеток).

Приготовление сухого реактива: нитропруссида натрия 1 г, сульфата аммония 20 г, карбоната натрия безводного 20 г. Отвешенные реактивы тщательно растирают в ступке до получения мелкого однородного порошка. Порошок хранят в хорошо закупоренной стеклянной банке в сухом месте.

Ход исследования: предметное стекло кладут на лист фильтровальной бумаги. На стекло помещают небольшое количество (на кончике ножа) сухого реактива или таблетку и наносят на него 2-3 капли мочи. При наличии кетоновых тел получается окрашивание от розового до темно-фиолетового (появление окраски может наступить в течение 2-3 мин) [9].

5. Билирубин. В норме в моче отсутствует. Определение билирубина в моче используют как экспресс-метод для дифференциальной диагностики гемолитических желтух и желтух другого происхождения. Билирубинурию наблюдают, главным образом, при поражении паренхимы печени (паренхиматозные желтухи) и нарушении оттока жёлчи (обтурационные желтухи). Для гемолитической желтухи билирубинурия не характерна, так как непрямой билирубин не проходит через почечный фильтр.

Принцип метода основан на диазореакции. При взаимодействии билирубина с солью диазония в кислой среде образуется окрашенный комплекс, интенсивность цвета которого увеличивается с увеличением концентрации билирубина. Цвет окрашенного соединения зависит от используемого индикатора. Проба может быть ложноотрицательная при наличии в моче больших количеств аскорбиновой кислоты, нитритов или мочевой кислоты, при длительном хранении мочи на свету, так свет вызывает разрушение билирубина. Ложноположительные результаты могут быть вызваны лекарственными препаратами, окрашивающими мочу в красный цвет или дающими красную окраску в кислой среде, а также при высоком содержании уробилина [9].

6. Уробилиноген (стеркобилиноген). Верхняя граница референтной величины уробилиногена в моче - 17 мкмоль/л. В клинической практике определение уробилинурии применяют для выявления поражений паренхимы печени, особенно в случаях, протекающих без желтух, для дифференциальной диагностики желтух (при механической желтухе уробилинурия отсутствует).

В настоящее время исследование проводят с помощью тест-полосок. В основе методики лежит реакция между уробилиногеном и п-диметиламинобензальдегидом с образованием комплекса, окрашенного в разовый или красный цвет. Интенсивность окраски соответствует концентрации уробилиногена. Ложноотрицательные результаты могут быть получены при длительном хранении мочи, особенно при действии солнечного света. Более высокие уровни уробилиногена наблюдаются после приема богатой углеводами пищи [9].

7. Кровь. Физиологическая микрогематурия при исследовании тест - полосками составляет до 3 эритроцитов/мкл мочи (1-3 эритроцита в поле зрения при микроскопии). Гематурию - содержание эритроцитов свыше 5 в 1 мкл мочи считают патологическим признаком. Основные причины гематурии - почечные или урологические заболевания. Гемоглобин при исследовании тест-полосками в норме отсутствует. Гемоглобинурия и миоглобинурия могут иметь место при тяжёлой гемолитической анемии, тяжёлых отравлениях, сепсисе, ожогах, инфаркте миокарда, повреждении мышц и тяжёлых физических нагрузках.

Принцип метода: гемоглобин и миоглобин, обладая пероксидазными свойствами, расщепляют импрегнированный в тестовую зону субстрат с образованием перекиси водорода, которая распадается на воду и атомарный кислород. Последний окисляет индикатор (производное соединение бензидина либо какой-то другой) с образованием окрашенного вещества. Гемоглобин и миоглобин равномерно меняют окраску всей тестовой зоны. Реакция более чувствительна к гемоглобину и миоглобину, чем к эритроцитам. К ложноотрицательным или заниженным результатам может привести высокое содержание аскорбиновой кислоты, высокое содержание белка и полное отсутствие гемолиза эритроцитов [9].

8. Нитриты. В норме в моче отсутствуют. Бактерии восстанавливают присутствующие в моче нитраты в нитриты. Поэтому обнаружение нитритов в моче свидетельствует об инфицировании мочевыводящих путей.

Исследуются с помощью диагностических тест-полосок. Принцип метода основан на химической реакции между нитрит-ионами и п-арсаниловой кислотой с образованием в кислой среде диазотированного соединения (реакция 1), реагирующего с ароматическим азотсодержащим соединением с образованием окрашенного комплекса от белого через слабо розововый до ярко розового или красного.

9. Лейкоциты. В норме в моче при исследовании тест-полосками лейкоциты отсутствуют. Тест на лейкоцитарную эстеразу положителен, если содержание лейкоцитов в моче превышает 10−20 клеток/мкл. Лейкоцитурия - признак воспаления почек и/или нижних отделов мочевого тракта [9].

Принцип метода: тест-зона для определения лейкоцитов содержит индоксилэфир, который выявляет эстеразу гранулоцитов. Индоксил запускает реакцию с солью диазония, при этом тест-зона меняет бежевую окраску на фиолетовую. Тест обнаруживает эстеразную активность в гранулоцитах и макрофагах, которые появляются при хронических воспалениях.