Второе место по частоте встречаемости занимают заболевания бактериальной природы

Один и тот же род бактерий может быть патогенен для рыб и в пресной, и в морской воде, донном иле и биопленке, находящейся на поверхности различных структур. Обычно отход рыб по причине бактериологических болезней связан с неблагоприятными для рыб условиями окружающей среды. Многие бактерии, вызывающие болезни рыб, являются обычно распространенными в окружающей среде видами. Но, также имеются и виды бактерий, которые какое-то время сохраняются в окружающей среде, а размножаются только в рыбах.

Первыми симптомами бактериальной болезни является снижение аппетита рыб. Точный диагноз болезни ставится на основании обнаруженных клинических изменений, результатов патологоанатомического вскрытия и бактериологического исследования органов рыб.

Бактерии представляют собой одноклеточные микроорганизмы, размножающиеся простым делением. Размер бактериальной клетки составляет 0,1-2,0 мкн. Бактерии различны по форме клетки (кокковидные, извитые, палоковидные, спиралевидные), а также по биохимическим свойствам.

Для идентификации вида бактерии используют различные питательные среды, помещенные в стерильные чашки Петри.

В настоящее время описано около 25 родов бактерий, способных вызывать вспышки заболеваний у пресноводных или морских видов рыб. К наиболее распространенным возбудителям болезней рыб относят бактерии рода: Aeromonas, Vibrio, Pseudomonas, Flavobacterium, Yersinia, Renibacterium.

По историческим причинам большая часть имеющейся информации диагностики заболеваний рыб основана на использовании традиционных культурально-независимых методов. Для индентификации возбудителей производили посев образцов крови, паренхиматозных органов, а также посев нераскрывшихся абсцессов, опухолей на универсальные (неспецифические) питательные среды, например, РПА (рыбо-пептонный агар), пресноводный агар. Большинство возбудителей болезней рыб хорошо растут на обычных питательных средах, что, с одной стороны, в значительной степени во многом упрощает диагностику, так как нет необходимости применять большое количество различных специфических сред, с другой стороны – для получения изолированный колоний по методу Дригальского необходимо применять большое количество чашек Петри со средой, так как на поверхности РПА очень хорошо растет сапрофитная микробиота.

Важно отметить, что используемая температура инкубации должна (хотя это не всегда имело место) отражать условия окружающей среды хозяина, и поэтому продолжительность инкубации должна быть больше при выделении бактерий у холодноводных видов рыб, где скорость роста патогенов, вероятно, будет чуть медленнее. Напротив, более высокие температуры и более короткие инкубационные периоды подходят для тепловодных видов рыб, например, 25 °C в течение 1–7 дней у представителей семейства карповых.

Конечно, следует отметить, что инкубационные периоды, но не температуры, должны быть скорректированы при использовании селективных питательных сред в соответствии с исследуемой бактериальной группой (ами).

Наиболее очевидные случаи включают использование селективных сред для подсчета видов Bifidobacterium, которые не являются распространенными или многочисленными представителями кишечной микробиоты рыб, и Escherichia coli, которая не является важным энтеропатогеном видов рыб. Хотя эти бактерии были идентифицированы в ограниченном количестве исследований на рыбе, существуют более релевантные бактериальные группы, которые являются более многочисленными и имеют известные значения для состояния здоровья рыбы, которые должны иметь приоритет. Кроме того, условия культивирования часто ошибочно устанавливаются при 37 °С в течение 24–48 часов. Эти методологические подходы подходят для оценки пригодных для культивирования микроорганизмов у млекопитающих, но не подходят для пойкилотермных животных, таких как рыба.

Поэтому первичные бактериологические посевы на питательной среде инкубируют при температуре 15 – 17 °С и 20 – 22 °С, отмечая интенсивность роста и морфологию колоний через 48 часов со дня проведения бактериального посева и после этого через день, в течение одной или нескольких недель, так как существуют возбудители, которые растут достаточно медленно.

После соответствующего инкубационного периода подсчитывают колонии и репрезентативное количество колоний пересевают для выделения. Дальнейшее исследование направлено на характер фенотипических и биохимических особенностей возбудителей. Основными тестами, проводимые с выделенными бактериями являются: окраска по методу Грама, определение подвижности, оксидазный тест, тест O-F (тест Окисление-Ферментация) и образование газа. В течение последнего десятилетия активно стали использовать секвенирования 16S рРНК.

 Традиционно, исследования патогенной микробиоты включали культурально-зависимые методы сомнительной чувствительности, которые выделяют только типично аэробные гетеротрофные бактериальные компоненты. Хотя традиционные культуральные методы доказали свою эффективность и высокую степень спефичности, но они часто занимают много времени и являются весьма дорогостоящими. Кроме того, ограничена возможность выявления тех патогенов, которые плохо поддаются культивированию. Следовательно, выявление микроорганизмов требует долгой рутинной практики выращивания, причем, таким образом, возможно идентификация лишь малого количества из всех известных патогенных бактерий.

Как часто бывает в случае микробных сообществ изолированных из проб окружающей среды, имеет низкую способность к культивированию в лабораторных условиях: по оценкам многих исследователей, культивирование с использованием питательных сред общего назначения составляет менее 0,1 % от всего микробного разнообразия. Хотя многие из таких «некультивируемых» микроорганизмов не поддаются изучению классическими метода идентификации в микробиологии, однако существует несколько подходов, позволяющих провести идентификацию. Одним из таких методов является – микроскопические наблюдения. Концепция о том, что многие микроорганизмы, наблюдаемые при прямом микрокопировании как живые, вступили в состояние «некультивируемая форма бактерий (НФБ)» была высказана американским микробиологом профессором Р. Колвелл в 1987 г. Было доказано, что только малая часть бактерий дает рост на питательных средах, хотя в природе они сохраняют свою вирулентность. В природных эконишах постоянно образуются НФБ, что было показано на примере патогенов человека – Legionella pneumophila, Salmonella enteritidis, Vibriocholera, Vibriovulnificus.Таким образом, микроскопические методы доказали свою важность для обнаружения НФБ, хотя при помощи данных методов можно дать лишь количественную оценку.

Трудности идентификации возбудителей заболеваний при использовании классических методов культивирования обусловили необходимость разработки молекулярных подходов. На сегодняшний день существует широкий спектр методов молекулярной диагностики, основанных на вариабельности последовательностей генов 16S и 23S рРНК, и за последние 10–12 лет такие подходы стали часто использоваться для специфической диагностики возбудителей заболеваний у рыб.

Ген 16S рРНК выбран как универсальный маркер для видовой идентификации: он имеется в геномах всех прокариот и обладает относительно малой изменчивостью.Прочтение последовательности осуществляется с помощью постановки ПЦР с использованием консервативных праймеров на домены Eubacteria и Archaea c последующей очисткой ДНК и секвенированием. Далее последовательность сравнивается с компьютерной базой данных с использованием алгоритма BLAST.

Метод секвенирования гена 16S рРНК является «золотым стандартом» точности видовой идентификации бактерий.

Используемые современные молекулярные подходы зависят от цели исследований: для анализа структуры и разнообразия микробных сообществ используется – гель-электрофорез в денатурирующем градиенте (Denaturing gradient gel electrophoresis) (DGGE), электрофорез во временном градиенте температуры (Temporal temperature gradient electrophoresis) (TTGE); для определения численности отдельных таксонов или общих микробных уровней – количественная ПЦР в реальном времени (quantitative real-time PCR) (qPCR) или флуоресцентная гибридизация in situ (Fluorescent in situ hybridization) (FISH); для идентификации состава микробиома рыб – библиотека клонов (Сlone libraries). Использование данных методов дает возможность обойти микробную изоляцию.

Благодаря молекулярным методам стало возможно наиболее полно определить структуру и разнообразие патогенов, что ускорило диагностику заболеваний у рыб и своевременное назначения лечебно-профилактических мер.

В будущем это позволило бы снизить нагрузку от антибактериальной терапии и исключает возможность развития устойчивых штаммов, а также получить интересные данные о микробном биоразнообразии рыб и выявить присутствие НФБ, включая анаэробов.

 

Фурункулез (ASS)

Возбудитель: возбудитель фурункулеза – грамотрицательная палочка Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida.

Устойчивость. Бактерии ASS сохраняются: в солено-пресной и пресной воде – от 15 суток (при 20 ^oC) до 50 суток (при 4 ^oC); в морской воде – порядка одной недели; в замороженной (-10 ^oC) или мертвой рыбе и во влажной почве – примерно один месяц; в сухих или влажных садах – около одной недели.

Эпизоотология: фурункулез встречается в рыбных хозяйствах повсеместно, практически в любой точке мира, где разводят лососевых. В Финляндии болезнь впервые была отмечена в 1986 году. Уровень заболеваемости зависит от штамма бактерии и вида рыбы. Возбудитель болезни выделен у многих видов рыб в естественных водоемах. В литературе имеется много примеров эпидемий фурункулеза лососевых в пресной, морской и солоноватой воде.

Течение и симптомы болезни: фурункулез встречается у рыб всех возрастных групп. Болезнь вспыхивает при температуре воды выше 10°С и в неблагоприятных условиях, например, при большой плотности посадки рыб, а также при дефиците кислорода.

Вследствие развития сепсиса мелкая рыба может погибать внезапно без видимых внешних симптомов. У крупных рыб симптомы заболевания различны: рыбы темнеют, не принимают пищу, у основания плавников, на жабрах и во внутренних органах появляются кровоизлияния, селезенка и почки увеличиваются в размере. Хроническая форма болезни встречается, как правило, лишь у рыб старшей возрастной группы. Типичными симптомами хронической болезни является образование в мышечной ткани рыбы фурункулов и язв. Они содержат бактерии и продукты распада тканей рыбы. Если фурункул разрывает кожу, то выливающаяся из него жидкость становится злостным источником бактериального заражения для других рыб. Если болезнь не лечить, то она может вызвать высокую смертность у рыб всех возрастных групп (рис. 4).

 

 

Рисунок 4 – У самок фурункулез часто вызывает гиперемию в основании грудных плавников (Фото: Пертту Коски, Evira)

 

Рисунок 5 – Обширное генерализованное воспаление, вызванное фурункулезом, признаками которого являются точечные кровоизлияния во внутренних органах рыбы (Фото: Пиа Веннерстрём, Evira).

 

Распространение: главными источниками распространения болезни являются больные рыбы, а также бессимптомные носители. Бактерии выделяются из жабр, кожи, сердца, надпочечников, печени и кишечника больных рыб. При низких температурах воды болезнь обычно имеет латентную форму. Бактерия также обитает на поверхности икринок, поэтому икра также служит источником распространения болезни, если ее не подвергать дезинфекции. Кроме того, путями распространения фурункулеза в хозяйстве могут служить вода и рыбоводный инвентарь.

Профилактика и лечение:Поскольку главными источниками фурункулеза являются больные рыбы и икра, то в местах их закупки обязательно следует проводить бактериологическое исследование. Для обеспечения чистоты икры ее дезинфицируют йодсодержащим веществом. В воде бактерию можно уничтожить, например, методом озонирования, ультрафиолетового облучения и хлорирования. Чтобы избежать передачи болезни через инвентарь, его следует тщательно дезинфицировать.

Для профилактики фурункулеза разработаны эффективные вакцины, приобрести которые можно у ветеринарного врача. Для предотвращения фурункулеза также важно обеспечивать оптимальные условия содержания рыб.

Для лечения болезни используются антибиотики, которые добавляют в корм. Так как возбудитель фурункулеза быстро вырабатывает штаммы, устойчивые (резистентные) к антибиотикам, необходимо регулярно проверять чувствительность к антибиотикам выделенных штаммов. При вспышке болезни погибших и погибающих рыб быстро удаляют и утилизируют надлежащим образом.

Ранее в определенных регионах фурункулез относился к болезням, с которыми следует вести борьбу, но в 2008 году он был исключен из этой категории, поскольку на данный момент против него существуют эффективные вакцины.

Однако посадка рыб, больных фурункулезом, не должна повлиять на санитарное состояние рыбоводных хозяйств и водоемов, расположенных вблизи места посадки или ниже по течению.

 

2.2 Иерсиниоз и болезнь «красный рот» (Enteric Red Mouth)

Возбудитель: иерсиниоз и болезнь «красный рот» вызываются энтеробактерией Yersinia ruckeri, которая является грамотрицательной палочкой. У данной бактерии выделено несколько типов, патогенность которых варьирует в зависимости от штамма, вида рыбы и ее иммунитета.

Эпизоотология: до 1981 года болезнь «красный рот» была известна лишь в Северной Америке и Австралии, позднее она была выявлена во Франции, а спустя несколько лет - и во многих странах Европы, включая всю Скандинавию. В начале 2000-х годов в Финляндии были обнаружены новые штаммы Yersinia ruckeri, вызвавшие высокую смертность в морских рыбоводных хозяйствах. Эти штаммы отличаются от ранее найденных в ближайших внутренних водоемах, как по генотипу, так и по результатам диагностических тестов. Болезнь, вызываемая морскими штаммами Y. Ruckeri, отличается от ранее описанной болезни «красный рот», широко распространенной в Европе, и называется иерсиниозом. Во внутренних водоемах Финляндии бактерия Y. ruckeri выделена как у диких рыб (окуня, плотвы, сига), так и у искусственно выращиваемых рыб, особенно у сига и лосося. Штаммы внутренних водоемов являются менее патогенными, чем морские штаммы.

Течение и симптомы болезни: Иерсиниоз и «красный рот» - хронические болезни, которые обычно вызывают стабильно низкую смертность. Болезнь может вспыхнуть у хронически больных рыб от стресса, полученного при обработке или при дефиците кислорода в воде, а также при изменении в неблагоприятную сторону других факторов внешней среды. Периодически бактерией Y. ruckeri также заражаются мальки, только что научившиеся принимать пищу. В начале острой стадии болезни рыбы становятся апатичными, у них развивается анемия. Для болезни «красный рот» характерны подкожные кровоизлияния, возникающие позднее вокруг рта и во рту. Подобная симптоматика не была зарегистрирована в Финляндии, в том числе для иерсиниоза. Для отмеченных в Финляндии заражений бактерией Y. ruckeri и случаев иерсиниоза характерны многочисленные точечные кровоизлияния в различных органах, например, на коже, в глазах, плавниках, жабрах и во внутренних органах, особенно в плавательном пузыре и мускулатуре. Селезенка увеличивается и становится хрупкой. Также может наблюдаться пучеглазие, в глазах заметны кровоизлияния, они даже могут вылезать из своих орбит. Задний отдел кишечника воспален и заполнен густой желтоватой жидкостью. Если рыба, зараженная иерсиониозом, подвергается стрессу, болезнь переходит из латентной стадии в активную и смертность значительно возрастает - до 75 %.

Распространение: болезнь распространяется при прямом контакте рыб и посредством воды. При ухудшении условий содержания бактерия начинает выделяться в больших количествах с фекалиями рыб. Дикие рыбы могут выступать в качестве переносчиков бактерий, тем самым поддерживая уровень заболеваемости и усложняя борьбу с болезнью.

Профилактика и лечение: против иерсиниоза и болезни «красный рот» разработаны эффективные вакцины. Надежный способ воспрепятствовать заражению хозяйства – выяснить историю заболеваний хозяйства-поставщика и провести исследования поступающих партий рыб на предмет наличия болезней. В приморских регионах болезнь широко распространена. Перенос бактерий с икрой не подтвержден, но икру следует дезинфицировать. При вспышке болезни применяются антибиотики, но спустя несколько недель после окончания лечения антибиотиками болезнь может начать развиваться заново.