Выделение, фракционирование и очистка белков

В лабораторной практике

Методы количественного определения белков, используемые

Для определения концентрации белков в биологических жидкостях и растворах используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.

Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:

- спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм.Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

- рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

- нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

- поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.

Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).

Выделение белков из тканей включает несколько этапов.

1. Гомогенизация (измельчение) ткани для разрушения клеточных и внутриклеточных мембран, препятствующих выделению белков. В процессе гомогенизации нередко добавляются детергенты.

2. Экстрагирование (растворение) белков проводят чаще всего слабыми солевыми растворами.

3. Отделение низкомолекулярных веществ (солей) методом диализа с использованием полупроницаемых мембран, методом гель - фильтрации.

4. Очистка белка от сопутствующих белков (фракционирование), основанная на различных физико-химических свойствах белков.

а) ультрацентрифугирование – разделение белков по молекулярной массе

б) электрофорез – разделение белков по заряду молекулы и молекулярной массе

в) фракционное высаливание – подбор концентрации соли для осаждения различных белков

г) хроматографические методы разделения:

· распределительная хроматография – по различной растворимости белков

· гель-фильтрация – по различной молекулярной массе белков

· ионообменная хроматография – по разнице зарядов белковых молекул

· аффинная хроматография – по химическим свойствам различных белков

5. Выделение белка в кристаллическом состоянии проводится путём лиофилизации при низкой температуре.