Циркулянтные опухолевые клетки (ЦКО)

ЦКО - это популяция редких раковых клеток, отделившихся от первичной опухоли и попавших в кровоток, став основной причиной метастазов в различных органах. Они появляются как потенциальные биомаркеры и неинвазивная альтернатива биопсии ткани для раннего обнаружения, диагностики и прогноза рака, чтобы улучшить клинические параметры пациентов [ 46 ]. Поскольку ЦОК - чрезвычайно редкие клетки в кровеносных сосудах (обычно менее 10 / мл крови), их выделение из миллиардов эритроцитов и миллионов лейкоцитов и их точная идентификация остаются проблемой. Их неоднородность (разнообразие форм поверхностных белков, размеров и физических характеристик) в зависимости от типа и стадии рака затрудняет их выделение, требуя чрезвычайно чувствительных и специфических методов распознавания [ 47 ]. В общем, обнаружение CTC включает четыре этапа, таких как захват, обогащение, обнаружение и окончательный выпуск. Этап захвата основан на специфических взаимодействиях между ЦОК и материалами (физическое взаимодействие или взаимодействие антитело / антиген). Стадия обогащения относится к выделению ЦОК из крови. Обнаружение ЦКО обычно выполняется с помощью флуоресценции, комбинационного рассеяния света с усилением поверхности (SERS) или измерений электрического импеданса. Наконец, обогащенные ЦОК выпускаются для дальнейшей идентификации фенотипа и молекулярного анализа [ 48 ]. На сегодняшний день было усовершенствовано несколько технологий обнаружения, обогащения и выделения ЦОК на основе химических или физических методов, таких как захват магнитными наночастицами (НЧ) [ 49 ], механическое разделение по разнице размеров [ 50 ], микрофлюидные подходы [ 51, 52 ] и методы иммунного распознавания [ 47 ].

Среди процедур антителозависимой изоляции, основанной на распознавании специфических биомаркеров, часто выполняются иммуномагнитные технологии с использованием функционализированных антителами анти-EpCAM магнитных НЧ для специфической нацеливания на клетки, экспрессирующие EpCAM (молекула адгезии эпителиальных клеток). Молекула адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) представляет собой трансмембранный гликопротеин, который обеспечивает межклеточную адгезию в эпителиальных тканях. Поскольку он обладает онкогенным потенциалом, он широко используется для улавливания ЦОК. На сегодняшний день единственной системой обнаружения ЦКО, одобренной FDA, является CellSearch ^®.анализ, хотя высокая стоимость изготовления ограничивает его использование. Набор основан на иммуномагнитном разделении для нацеливания на конкретный антиген с помощью антител против EpCAM, связанных с магнитными шариками. Последующее разделение комплекса антиген-антитело может быть достигнуто путем воздействия магнитного поля [ 53 ].

Разработка надежных, экономичных и чувствительных технологий обнаружения и выделения ЦОК играет ключевую роль в ранней диагностике и лечении рака. Наноматериалы предлагают отличные преимущества для повышения чувствительности при обнаружении биомолекул из-за их большого отношения площади поверхности к объему и аналогичного размера по сравнению с биомолекулами [ 54 ]. Многие классы наноматериалов были включены в исследования СТС для высокочувствительного и селективного захвата клеток, например, магнитные и золотые наночастицы, углеродные нанотрубки, дендримеры, квантовые точки и оксид графена (GO) [ 55 ]. В частности, последние достижения в нанонауке позволили разработать наноархитектуры на основе многофункциональных G-платформ для выделения и идентификации ЦОК, что представляет собой технологический прогресс в жидкой биопсии [ 56 ]. Фактически, легкость поверхностных химических модификаций вместе с его уникальными оптическими свойствами делают GO привлекательным материалом для обнаружения биомолекул [ 56 ], а наиболее часто используемые стратегии выделения ЦОК основаны на традиционной иммуномагнитной сепарации, электрохимической технологии и микрофлюидных инструментах. [ 47 ]. Из-за диамагнитных свойств всех необработанных биологических материалов магнитное разделение клеток с использованием биоконъюгированных магнитных материалов может быть эффективно применено для отделения ЦОК от цельной крови высокоспецифическим способом посредством целевого связывания и последующего разделения с помощью стержневого магнита, избегая света. рассеяние и фон автофлуоресценции от клеток крови.

Комбинация квантовых точек оксида графена (GOQD) и магнитных наноплатформ в единую наноархитектуру, функционализированную антителом против GPC3 (Glypican 3), была предложена для точной идентификации и селективного захвата ЦКО опухолей рака печени [ 57 ]. Стратегия электрохимического зондирования, основанная на функционализированном аптамером и декорированном массивом золотых наночастицах магнитном графеновом нанолисте (AuNPs-Fe ₃ O ₄-GS) сообщалось о мониторинге и улавливании ЦОК в цельной крови человека. Датчик использует комбинацию двух эффектов: эффективное распознавание и захват целевых ЦОК, обеспечиваемое выбранными аптамерами, и усиление сигнала, гарантируемое функционализацией наночастиц золота (AuNP) электроактивными частицами (6-ферроценил-1-гексантиол). или тионин) [ 58 ].

Было предложено несколько микрофлюидных устройств на основе ГО для обогащения ЦОК на основе их различных биохимических свойств по отношению к другим компонентам крови человека. Большинство этих устройств ориентированы на технологии, основанные на иммуноаффинности, которые используют специфические антитела, широко экспрессируемые в раковых клетках, для выделения ЦОК с высокой чистотой и чувствительностью.

Сообщалось о микрожидкостном чипе на основе GO с точным дизайном захвата поверхности для выделения ЦОК от пациентов с метастатическим раком молочной железы с высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Использование ГО в качестве основного материала для конъюгации антител позволяет чипу обнаруживать ЦОК только в 1 мл крови с высоким выходом и воспроизводимостью благодаря презентации антител с высокой плотностью [ 59 ].

Микрожидкостное устройство, использующее иммунозахват на основе настраиваемого термочувствительного полимера-GO-чипа, было предложено для высокоэффективного захвата и последующего высвобождения ЦОК у пациентов с раком груди и поджелудочной железы. Микрожидкостное устройство покрыто композитной пленкой функционализированного GO, диспергированного в термочувствительной полимерной матрице. Комбинация биосовместимого ГО, должным образом функционализированного для иммунозахвата, с термочувствительным полимером обеспечивает температурно-зависимую модуляцию захвата / высвобождения, обеспечивая эффективное высвобождение клеток для анализа после захвата. Это устройство преодолело общий недостаток большинства технологий на основе иммуноаффинности, основанных на антителах, прикрепленных к поверхности захвата, что препятствует высвобождению жизнеспособных клеток [ 60 ]. Электрохимическая технология также применима для восстановления ТХМ. Платформа электрохимического зондирования на основе графена, основанная на функционализированных модифицированных графеном стеклоуглеродных электродах (GCE), была разработана для инкубации с клетками млекопитающих (т. искусственные образцы ХОК). Взаимодействия с компонентами клеточной поверхности, ответственными за конъюгирование клеток-мишеней на поверхности электрода, были преобразованы в сверхчувствительный электрохимический ответ. Химическое разнообразие, предлагаемое графеновыми зондами, позволило различать клеточную поверхность / тип клеток, выступая в качестве сенсорной матрицы с селективными рецепторами. Преимущество такого подхода к зондированию на основе массивов заключается в возможности сделать общую сигнатуру ЦОК, 61 ]. Пористый оксид графена (PGO) был использован для украшения поверхности светоадресного потенциометрического сенсора (LAPS), за которым следует закрепление аптамера AS1411 (apta-PGO-LAPS), и был исследован как светоадресный потенциометрический сенсор. Интерфейс считывания СТС использует интеграцию электронных датчиков с надежным и специфическим биозондом СТС (аптамером). В частности, аптамерный зонд AS1411 обладает высокой аффинностью связывания и специфичностью по отношению к сверхэкспрессированному нуклеолину на мембране ЦОК [ 62 ].

Недавно был предложен датчик для обнаружения ЦКО в клиническом образце на основе функционализированного аптамером AS1411 графенового полевого транзистора (GFET) с использованием восстановленного ГО, опосредованного тетра (4-аминофенил) порфирином, в качестве материала канала. Стратегия определения аптамера была применена для выделения ЦОК линии клеток рака легких человека A549, рака груди MDAMB-231 и рака шейки матки HeLa с хорошей чувствительностью [ 63 ].

Универсальный супер-сэндвич-цитосенсор на основе 3D-микрочипа, модифицированного GO, и нанокомпозитов из диоксида кремния, покрытых золотом (Si / AuNP), изготовленных с помощью фотолитографии, был разработан как чувствительная к СТС система количественного обнаружения. Датчик объединяет два функциональных компонента: (1) покрытие против EpCAM на GO для распознавания / захвата клеток, экспрессирующих EpCAM, и (2) пероксидаза хрена (HPR) и анти-CA15-3 (Ab2), загруженные в Si / AuNP для повысить селективность клеток-мишеней и усилить электрохимический сигнал обнаружения. Эффективность была оценена на MCF7 клетках рака молочной железы, показывая высокую чувствительность с широким диапазоном от 10 ¹ до 10 ⁷ клеток мл ^-1 и предел обнаружения 10 клеток мл ^-1 [ 64 ]. Платформа для изоляции CTC, основанная на листах полиэфирной ткани, функционализированных GO, несущих антитела против EpCAM, была предложена в качестве недорогой, простой в установке и одноразовой платформы, обеспечивающей высокую чувствительность. Эффективность захвата 75–80% была получена для клеток с высокой экспрессией EpCAM [ 65 ].

Трехмерная иерархическая наноструктурированная пена, захватываемая клетками графена с покрытием против EpCAM (пена rGO / ZnO / anti-EpCAM) была предложена для распознавания / захвата EpCAM-экспрессирующих раковых клеток, демонстрируя некоторые преимущества по сравнению с устройствами на основе микрофлюидов, такими как простота изготовления, увеличенная частота контакта клетки с субстратом во всех направлениях, микропористость, которая позволяет нормальным эритроцитам проходить сквозь них, но избирательно захватывает ЦОК, благодаря покрытию против EpCAM. Характеристики этой трехмерной пены были исследованы с использованием EpCAM-положительных линий раковых клеток (MCF7, клетки рака молочной железы), в результате чего выход захвата клеток достигал 58% после времени инкубации в течение 30 минут [ 66 ].

Для более полного обогащения ЦОК особое внимание необходимо уделить выбору антител. Комбинируя разные антитела в одном наноустройстве, можно достичь более высокой эффективности захвата, чем при распознавании одного биомаркера. Пленки восстановленного оксида графена (rGO), функционализированные антителами против EpCAM и антигеноспецифического мембранного антигена (анти-PSMA), были недавно изготовлены путем распыления раствора rGO на гладкое предметное стекло. Эти антитела с модифицированной RGO пленки показали высокую эффективность (60%) CTC захвата из крови больных раком предстательной железы с простат-специфического антигена (ПСА) уровнях 4-10 нг мл ^-1 [ 67 ].