Нуклеиновые кислоты циркулирующих опухолей (ctNAs)

Циркулирующие опухолевые нуклеиновые кислоты (цтНК), такие как циркулирующая внеклеточная ДНК, РНК, микроРНК (рис. 1), представляют собой инновационный инструмент для жидкостной биопсии [ 2, 78, 79 ]. Уровни ctNA, по сравнению с другими циркулирующими свободными биомаркерами (такими как CTCs), обнаруживаются в кровотоке на ранней стадии; поэтому их можно использовать для первичного обнаружения опухолей и мониторинга болезни [ 80 ]. К настоящему времени исследованы несколько подходов к обнаружению цтНК, основанных на флуоресценции, SERS-спектроскопии, радиохимическом, ферментативном подходе, хемилюминесценции [ 46, 81, 82 ]. К сожалению, обнаружение этих биомаркеров затруднено из-за их небольшого размера и низкой концентрации в жидкостях организма [ 80 ]. Были предложены различные сверхчувствительные методы обнаружения, включая амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот [ 83 ], амплификацию по методу катящегося круга (RCA) [ 84 ] и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [ 85 ]. Однако сложность, высокая стоимость реагентов и оборудования, а также трудоемкие протоколы не позволяют реализовать эти стратегии на рынке. Для преодоления некоторых из этих недостатков в последние годы были предложены также электрохимические подходы, характеризующиеся более низкой стоимостью и высокой чувствительностью обнаружения за счет усиления сигнала [ 86 ].

GO и rGO были выбраны в качестве сенсорных платформ для обнаружения циркулирующих олигонуклеотидов и клеток с помощью флуоресцентной спектроскопии из-за их способности адсорбировать одноцепочечные (ss) олигонуклеотиды с помощью нековалентных подходов (π-π взаимодействия и / или водородные связи) [ 87 ]. В то же время GO и rGO показали более низкое сродство к двухцепочечным (ds) олигонуклеотидам из-за плохой доступности азотистых оснований внутри двойной спирали и меньшей способности адсорбировать более длинные олигонуклеотиды из-за более низких процессов диффузии [ 88 ]. Более того, материалы G способны почти полностью подавлять флуоресцентное излучение флуоресцентного красителя, связанного с ss-олигонуклеотидом. В присутствии комплементарных олигонуклеотидов-мишеней (циркулирующих олигонуклеотидов) ss-олигонуклеотиды, помеченные флуоресцентным красителем, могут высвобождаться G-поверхностью и образовывать комплекс с комплементарным олигонуклеотидом-мишенью, восстанавливая флуоресцентную эмиссию, что позволяет идентифицировать фрагменты циркулирующих олигонуклеотидов.

Платформа биочувствительности, способная одновременно обнаруживать и оценивать количество miR-141 и miR-21 (две miRNA, сверхэкспрессируемые на ранней и поздней стадии рака простаты) из нескольких жидкостей организма (кровь, моча, слюна), была исследована Салихом. Hizir et al. [ 89 ]. Способность GO адсорбировать ss-ДНК на своей поверхности и подавлять эмиссию флуоресценции была использована для создания платформы GO, сконструированной с двумя меченными флуорофором антисмысловыми цепями ДНК: меченным флуоресцеином амидитом (FAM) анти-miR-21 и меченным Cy5. анти-miR-141. Платформа приводила к гашению флуоресценции при 520 нм (канал FAM) и 670 нм (канал Cy5). В присутствии сверхэкспрессированной miR-21 наблюдалось усиление флуоресцентного сигнала при 520 нм, тогда как сверхэкспрессия miR-141 индуцировала усиление флуоресцентного сигнала при 670 нм. Нецелевые miRNAs вызывали только меньшее увеличение флуоресценции в этих каналах; следовательно, увеличение флуоресцентного сигнала при 520 или 670 нм указывает на присутствие miR-21 или miR-141, и увеличение интенсивности сигнала флуоресценции использовали для определения концентрации фрагментов miR-21 и miR-141. Система была предложена не только для выявления рака простаты, но и для оценки стадии его развития. К сожалению, низкая чувствительность и низкая специфичность - типичные проблемы этих наноустройств, препятствующие их клиническому применению [ 89 ].

Robertson et al. Сообщили о новой системе ГО-полимер-олигонуклеотид (nGO-PEGMA / M2) и ферменте (ДНКаза I), способной обнаруживать miR-10b в пуле РНК, взятом из метастатических клеток рака молочной железы. [ 90 ]. Встраивание специфического фрагмента ошибочного спаривания в последовательность зонда вызывало повышение специфичности в отношении miR-10b, олигонуклеотида, сверхэкспрессируемого при раке молочной железы. Система nGO-PEGMA / M2 ДНКаза I смогла отличить miR-10b от miR-10a, которые отличались только одним нуклеотидом. Присутствие эндонуклеазы ДНКазы I улучшало флуоресцентную чувствительность зонда, но также улучшало фоновый флуоресцентный сигнал. Чтобы преодолеть этот недостаток, край GO был функционализирован с помощью PEGMA, что затрудняло доступ ДНКаза I на поверхности ГО, чтобы избежать увеличения фонового сигнала флуоресценции из-за нежелательной ферментативной активности [ 90 ].

Комбинация гасящих свойств ГО и метода циклической ферментативной амплификации (СЕАМ) позволила разработать зонды ГО / оцДНК, способные обнаруживать и различать несколько миРНК mir-21 в среде клеточного лизата. Повышающая регуляция экспрессии miRNA mir-21 участвует в росте солидной опухоли. Биологические среды были получены из клеточной линии карциномы легкого А-549 и эпителиальных клеток молочной железы MCF-10A. Присутствие комплементарной миРНК индуцировало восстановление флуоресценции из-за образования комплекса миРНК / ДНК, ранее подавленного ГО. Впоследствии миРНК, высвобожденная в результате переваривания ДНКазой I, может образовывать комплекс с другим зондом оцДНК на поверхности ГО, чтобы начать другой цикл, усиливая флуоресцентный сигнал до тех пор, пока все высвободившиеся пробы оцДНК не будут полностью израсходованы [ 91 ].

В присутствии двухвалентной соли GO не может различать ssNAs и dsNAs [ 92 ]. Напротив, rGO показал более высокую селективность в отношении miRNA по сравнению с GO в тех же условиях адсорбции [ 93 ]. Принимая во внимание эти данные, Yan et al. разработали магнитную систему на основе rGO (магнитные шарики @ APTES @rGO), способную избирательно адсорбировать miRNA из пула РНК, выделенного из плазмы здорового человека [ 88 ]. Магнитные шарики использовались для ускорения процесса экстракции центрифугированием. Более того, обратная транскрипция in situ (RT), такая как стратегия амплификации по катящемуся кругу (RCA), была применена для десорбции и обнаружения miRNA с помощью поверхности rGO [ 88 ].

Некоторые задачи были также сосредоточены на обнаружении как циркулирующей ss / ds ДНК. Ruiyi et al. разработали легированный азотом биосенсор с множественными графеновыми аэрогелями и нанозвездами из золота (N-легированный MGA / GNS), способный обнаруживать дцДНК в сыворотке крови человека с помощью электрохимического метода [ 94 ]. Гибридная система MGA / GNS с примесью азота показала повышенную электрокаталитическую активность по отношению к Fe (CN) ₆ ^{3- / 4-} в присутствии дцДНК, что было продемонстрировано амперометрическим детектированием. Авторы приписывают такое поведение взаимодействию между ДНК и недостаточно скоординированными сайтами Au (I), связанными на поверхности MGA-5, легированной азотом [ 94 ]. Другой электрохимический биосенсор, состоящий из G, украшенного наностержнями Au и пленкой политионина (G / Au NR / PT), нанесенной на стеклоуглеродный электрод (GCE), был разработан Huang et al. для обнаружения ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) в сыворотке крови человека [ 95 ]. G использовался для увеличения площади поверхности и электропроводности системы; Au NR (наностержни Au) использовали для увеличения иммобилизации ДНК-зонда; политионины были выбраны из-за их хорошей способности к переносу электронов и из-за их способности связывать поверхности Au NR своими аминогруппами. Тиолированные зонды захвата (ЗП) были иммобилизованы на биосенсоре за счет электростатических взаимодействий и ковалентных связей Au – S. CP был гибридизован с одним концом ДНК-мишени (TD), который возник из длинных концевых повторяющихся последовательностей HPV-16. Кроме того, были разработаны два вспомогательных зонда (AP) для комплексирования TD (фрагмента, который должен быть обнаружен в сыворотке человека) с помощью процесса самосборки на больших расстояниях. Наконец, дихлорид 1,10-фенантролинерутения ([Ru (phen) ₃ ] ²⁺) использовался в качестве электрохимического индикатора из-за его способности связывать ДНК электростатическими взаимодействиями. Увеличение сигнала электрохимического отклика зависело от количества ([Ru (phen) ₃ ] ²⁺), связанного с наноструктурой ДНК. Стоит отметить, что две последовательности AP могут связываться друг с другом на поверхности биосенсора, создавая значительную протяженную самособирающуюся наноструктуру ДНК только в присутствии TD [ 95 ].