Клещи Varroa и насекомые-паразиты

Автор настоящего изобретения получил несколько патентов на композиции и способы с использованием преспорулирующего мицелия энтомопатогенных грибов в качестве аттрактанта и средства обрабокти для контроля насекомых, и более широкие патенты находятся на рассмотрении (патентная заявка США № 13/986978) в отношении членистоногих, и вызывающих заболевания насекомых, и членистоногих-векторов (патентные заявки США № 13/317613 и 13/373719). Клещи Varroa известны в качестве вектора для израильского вируса острого паралича и вирусов кольцевой пятнистости табака. Клещи Varroa, являющиеся клещами, кусающими как растения, так и насекомых, содержат более одного вирусного или бактериального патогена, что означает, что клещи являются одним, хотя и значительным, вектором, несущим и вносящим множество патогенов при атаке, угрожающей здоровью улья, поскольку пчелы ослабевают под воздействием вируса, например они в меньшей степени способны избавляться от прикрепляющихся клещей Varroa. Однако мицелий энтомопатоненных грибов, в частности Aspergillus flavus, Metarhizium anisopliae и Beauveria bassiana, можно использовать для привлечения, истощения или уничтожения клещей Varroa, снижая их активность, доставку патогенных грузов и количеств патогенов, таким образом, склоняя равновесие в сторону улучшения иммунной защиты колонии против CCD. Аналогично споры энтомопатогенных грибов, включая Metarhizium, Beauveria и Entomophthorales, можно использовать для истощения или уничтожения клещей Varroa, хотя клещи могут находить споры отталкивающими по сравнению с преконидиальным мицелием.

Более того, экстракты Metarhizium anisopliae можно получать специально для привлечения, но не уничтожения насекомых, в том числе пчел, путем выращивания штаммов Metarhizium anisopliae, которые не содержат деструктинов, или имеют сниженные уровни их или других токсинов, или сниженную вирулентность и патогенность. Существует вариабельность токсинов по сравнению с многими штаммами Aspergillus flavus, известного энтомопатогенного гриба, в основном токсичного вследствие его содержания афлатоксина. В настоящее время доступны свободные от афлатоксина штаммы Aspergillus flavus, которые являются встречающимися в природе или могут быть получены посредством селекции культур или генетических модификаций. Также можно создавать свободные от деструктинов штаммы Metarhizium anisopliae, подвергать селекции или получать на основе природных геномов. Также можно получать

- 21 032759 штаммы, которые не полностью свободны от деструктинов или афлатоксинов, но продуцируют настолько низкие их уровни, что они могут быть токсичными для клещей, но не очень токсичными для пчел вследствие того факта, что уровни и каскады цитохрома Р450 пчел усиливаются под воздействием кумаринов и других полифенолов, презентируемых мицелием. По существу, активация цитохромов Р450 (CYP) может помочь пчелам лучше переносить или детоксифицировать деструктины или афлатоксины, воздействию которых пчелы подвергаются из Metarhizium anisopliae и Aspergillus flavus, и другие токсины, продуцируемые энтомопатогенными грибами.

Преимущество свободного от деструктина штамма или штамма со сниженным уровнем деструктина Metarhizium anisopliae состоит в том, что могут быть получены экстракты мицелия с высоким содержанием сахаров и терпенов, которые могут одновременно привлекать пчел и клещей. Применение решетки соответствующего размера, или барьера, или других средств селекции позволяет отделение клещей от пчел, так что как пчелы, так и клещи, могут первоначально привлекаться в одну и ту же область с экстрактами (или аналогично привлекаться к преконидиальному мицелию). Пропорциональность эндемических энтомопатогенных токсинов может быть сбалансирована так, чтобы истощать клещей, но не пчел. Использование одного или нескольких экстрактов грибов, как описано в настоящем описании, обеспечивает свободу и гибкость индивидуального исполнения, так что можно получать многочисленные устройства, системы доставки, композиции и способы, доступные впервые, чтобы улучшить состояние здоровья пчел и снизить CCD. Горбатки, комары и клещи, питающиеся грибами, хорошо известны в грибной промышленности. Не было известно, что экстракты энтомогенных грибов перед споруляцией являются привлекательными для этих насекомых и членистоногих. Автор настоящего изобретения полагает, что водно-этанольные экстракты грибов или мицелия грибов с этими аттрактантными свойствами не были известны в грибной промышленности до описания автором изобретения в совместно рассматриваемых и одобренных патентах.

Комбинирование щавелевой кислоты с обогащенной сахаром водой, нагруженной спорами или преконидиальным мицелием энтомопатогенных грибов, таких как Metarhizium anisopliae и Beauveria bassiana, улучшит митоцидное действие комбинации щавелевой кислоты и энтомопатогенных грибов и митицидные свойства других компонентов, находящихся или добавленных, например к воде с сахаром, лепешкам из пыльцы или средствам для опрыскивания пчел. Однако щавелевая кислота реагирует с минералами в экстрактах грибов, и это является препятствием для эффективного составления.

При комбинировании щавелевой кислоты с экстрактами нитчатых грибов базидиомицет содержащиеся в них минералы (кальций, фосфор, железо) могут связываться с щавелевой кислотой, таким образом, снижая выщелачивание минералов, митицидный потенциал щавелевой кислоты. Таким образом, вариантом осуществления настоящего изобретения является деминерализация экстрактов грибов до комбинирования щавелевой кислоты с экстрактами грибов. Для деминерализации можно использовать любой из многочисленных способов, пригодных для деминерализации экстрактов грибов, чтобы предотвратить преобразование реакционноспособной щавелевой кислоты в нерастворимые в воде соли посредством устранения кальция и других минералов, находящихся в экстрактах грибов. Одним из множества доступных способов является применение технологий ионообменных смол. Экстракты грибов можно добавлять в дистиллированную воду предпочтительно в соотношении 1:10, с диапазонами от соотношения 1:1, являющегося наиболее концентрированным, до 1:100, являющегося наиболее разбавленным, но они являются менее предпочтительными. После завершения минералы в экстрактах грибов, которые в ином случае могут нейтрализовать митицидные свойства щавелевой кислоты, могут быть по большей части или даже полностью удалены. После этого щавелевую кислоту можно добавлять к экстрактам грибов с уменьшенным содержанием минералов в достаточном количестве, чтобы они имели митицидный эффект, в диапазоне 1-10% щавелевой кислоты по массе раствора, достигая низкого значения рН в диапазоне рН 0,5-3,5 с оптимальным диапазоном рН 0,5-2,0.

Мы пытаемся понять ботанические источники и виды биологической активности смол в полевых условиях и то, как поведение добывания смолы изменяется в ответ на факторы внешней среды, такие как инфекция и другие биологические стрессовые факторы. Если бы мы могли открыть растения с предпочтительными и более антимикробными смолами в различных областях, было бы возможным создание окружающей среды, которая улучшает здоровье пчел путем поддержания поведения и организационных стратегий, которые приводит к естественной устойчивости к заболеваниям. Wilson et al., Metabolomics reveals the origins of antimicrobial resins collected by honey bees. PLoS One 8(10): e77512, page 11. Автор настоящего изобретения полагает, что чистые культивируемые грибы и мицелий грибов, включая аттрактанты грибов, энтомопатогены грибов, иммуностимуляторы грибов, противовирусные соединения, антибактериальные соединения и противогрибные соединения грибов могут аналогичным образом поддерживать здоровье пчел и приводить к природной устойчивости к заболеваниям и пестицидам. Пчелы полезны для экосистем и экономики, которые в ином случае будут страдать без этих грибных лекарственных средств.

Автор настоящего изобретения также ожидает, что эффекты изобретения также будут полезными для опыляющих насекомых и животных (летучие мыши). Также ожидается, что аналогично птицам могут быть полезны сходные комплексные решения на основе грибов посредством добавления в корм пи

- 22 032759 тающихся нектаром животных и птиц вследствие активации иммунологических генов и генов детоксикации, а также получения противовирусной пользы, таким образом, продлевая продолжительность жизни.

Нитчатые базидиомицеты также являются источниками нейродегенеративных соединений. Виды Hericium (включая, но не ограничиваясь ими Hericium erinaceus, Hericium corralloides и Hericium abietis) продуцируют мощные факторы роста нервов, вызывающие регенерацию миелина на аксонах нервов и регенерацию нервов. См. Stamets, Lion's Mane: A Mushroom That Improves Your Memory and Mood?, The Blog, Huffington Post Healthy Living, 08/08/2012. Псилоцибинипсилоцибинсодержащиегрибы, включая, нонеограничиваясьими, виды Psilocybe, Panaeolus, Gymnopilus, Pluteus и Conocybe, такиекак Psilocybe azurescens, Psilocybe cyanescens, Psilocybe allenii, Psilocybe cyanofibrillosa, Psilocybe cubensis, Psilocybe ovoideocystidiata, Psilocybe subaeruginosa, Copelandian Panaeoli (Copelandia cyanescens, Copelandia tropicalis, Copelandia bispora), Pluteus salicinus, Gymnopilus luteofolius, Gymnopilus spectabilis, Conocybe cyanopus и Conocybe smithii могутзапускатьнейрогенез. (См. Catlow et al., Effects of psilocybin on hippocampal neurogenesis and extinction of trace fear conditioning, Exp Brain Res (2013) 228:481-491 DOI 10,1007/s00221-013-3579-0). По отдельности или в комбинации смеси экстрактов, содержащих псилоцибин грибов и плодовых тел грибов Hericium или более предпочтительно экстрактов их мицелия, могут способствовать восстановлению нейронов, поврежденных токсинами, холинэргическими пестицидами, окислением, старением или другими источниками нейротоксинов. Суммарный эффект употребления этих смесей регенерирующих нервы грибов Hericium и псилоцибиновых видов могут улучшить нейрологическое здоровье пчел посредством нейрогенеза и ремиелинизации, и, безусловно, животных, в том числе человека. Другая улучшенная форма микологического меда может включать эти элементы для пользы пчел и людей, улучшая когнитивные способности, препятствуя или восстанавливая после нейропатий, которые проявляются как заболевания у человека, входящие в объем определений болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, паркинсонизма, MS (рассеянный склероз) или еще некатегоризированных форм нейрологических нарушений. Действительно такие комбинации могут улучшить умственные способности, способности к ощущению, память, рефлексы, время реакции и способность к решению проблем. В сущности, предполагается, что такой интеллектуальный микологический мед входит в объем настоящего изобретения.

Ganoderma lucidum являются одним из представляющих особый интерес видов (вместе с Ganoderma resinaceum, Ganoderma applanatum, Ganoderma brownii, Ganoderma curtisii, Ganoderma oregonense, Ganoderma tsugae, Ganoderma lingzhi, Ganoderma capense, Ganoderma annularis и Ganoderma collosum) для автора изобретения, поскольку они не только обладают выраженными противовирусными свойствами, но также имеют комплексы сахаров, которые обеспечивают мицелий, продуцирующий подобный вязкому сиропу микологический мед, который можно использовать для способствования выживанию пчел при CCD. Автор изобретения и его коллеги в Fungi Perfecti, LLC, также отметили, что экстракты Ganoderma resinaceum на замерзают, даже когда сублимационные сушилки достигают температур менее -50 С° в высоком вакууме, в то время как экстракты исследованных видов за пределами рода Ganoderma быстро сублимируются в сухое состояние в тех же условиях. Автор изобретения полагает, что экстракт мицелия Ganoderma resinaceum, и, вероятно, экстракты родственных видов Ganoderma, сохраняют жидкое состояние даже в криогеных условиях вследствие их уникального ассортимента комплексных сахаров, стеринов и гликопротеинов, связывающихся с образованием уникальной жидкой матрицы, значительно отличающейся от любых других исследованных видов. Этот экстракт может иметь потенциал в качестве средства против замерзания с широкими применениями для медицины, авиационной радиоэлектроники, космических полетов и может быть использован в условиях крайних температур для химии смазок, консервантов и экстремофилов.

Во всех из представленных ниже примеров автор настоящего изобретения ожидает в качестве следствий его изобретения, что способы биологически направленного фракционирования обеспечат увеличение активности, повышение эффективности и снижение стоимости получения, производства и внедрения указанных изобретений и его многих вариантов, которые станут очевидными после этого сдвигающего парадигму изобретения.

Пример 1.

Fomes fomentarius, Fomitopsis officinalis, Fomitopsis pinicola, Ganoderma resinaceum, Inonotus obliquus, Piptoporus betulinus, Trametes versicolor, Schizophyllum commune и другие виды грибов культивируют и мицелий выращивают на рисе, ячмене, льняном семени и других зернах, сельскохозяйственных отходах или продуктах лесоводства, таких как древесные опилки или древесная щепа (для перечня субстратов см. Stamets, Growing Gourmet and Medicinal Mushrooms, 1993, Ten Speed Press, Berkeley, Ca. и Stamets & Chilton, The Mushroom Cultivator, Agarikon Press, Olympia, WA). Когда мицелий достигает массы роста (предпочтительно после выращивания в течение 5-60 суток при ферментации или твердофазной ферментации после инокуляции, но задолго до образования плодового тела) мицелиальную массу можно экстрагировать простым промыванием субстрата водой, смесью вода/этанол (оба из которых являются предпочтительными), или этанолом, или путем сжатия субстрата, все из которых приводят к жидкому текучему или пригодному для поглощения экстракту, включающему внеклеточные экссудаты. Эти экстракты можно использовать как есть или к водным экстрактам можно добавлять спирт (25-50 об.%) в

- 23 032759 качестве консерванта и растворителя (который будет преципитировать растворимые в воде полисахариды). Водно-этанольный экстракт можно выпаривать или удалять или спирт и воду можно выпаривать или удалять по отдельности. Неочищенный экстракт можно подвергать фильтрованию для удаления клеток с использованием 0,12-0,20-мкм фильтра. Этот экстракт можно замораживать или сушить для последующего применения. Альтернативно можно использовать экстракты в неводных или неэтанольных растворителях, таких как DMSO, этилацетат, простой эфир и другие растворители или комбинации растворителей, известных в данной области, или можно использовать субкритические или сверхкритические жидкие экстракты с использованием, например, диоксида углерода или воды и необязательных сорастворителей, таких как спирты, или можно использовать экстракты, полученные посредством обработки микроволновым излучением.

Экстракт можно добавлять к любой форме пищевого сырья для употребления пчелами. Исходный экстракт можно использовать непосредственно или разбавлять и добавлять в их питьевую воду, воду с сахаром, пчелиный леденец, мед, прополис, лепешку из пыльцы, лепешку из жира и белковые добавки для получения улучшенных кормов для пчел и питательных продуктов и улучшенных добавок к пыльце, пищевых добавок, добавок в корм и питательных добавок. Экстракты также можно включать в спреи, используемые для опрыскивания ульев, компонентов ульев, липких полосок, пчел и растений, и включать в воск, используемый для изготовления сот и магазинов. Употребление и контакт с ними пчел улучшает способность пчел к формированию иммунитета посредством активации ферментов, деградирующих токсины, снижает нагрузку патогенами и обеспечивает полезный для здоровья источник разнообразных сахаров, аминокислот, витаминов группы В и питательных веществ. Более того, преципитат, хотя и отделенный от супернатанта, является богатым питательными веществами и обладает противовирусными, поддерживающими здоровье свойствами, и его также можно использовать в качестве сырья для пользы пчел. Как супернатант, так и преципитат, можно комбинировать и ферментативно конвертировать с использованием амилазы и других ферментов для дальнейшей трансформации крахмалов и других ингредиентов в более эффективную композицию.

Пример 2.

Мицелий медицинских грибов выращивают с использованием способов жидкой культуры. В то время как выращивание на рисе может обеспечивать 30-40% конвертирование риса в мицелий, жидкая культура в емкости может иметь, по существу, полную конверсию с в >3х большим количеством мицелия на единицу массы. Таким образом, жидкая культура мицелия в емкости и его внеклеточные метаболиты проще использовать для разработки по настоящему изобретению, поскольку процесс с использованием культуры в емкости устраняет необходимость в удалении не метаболизированных ингредиентов субстрата.

Пример 3.

Для получения экстракта мицелия используют равные объемы мицелия, выращенного на зерне (ячмень, льняное семя, рис, рожь, миллет, пшено, рожь, кукуруза), семенах, в том числе орехах, древесных опилках или древесной щепе (калифорнийская пихта, сосны, дубы, березы, хлопковые деревья, оливы), и его погружают в раствор вода-этанол 50:50. Ему позволяют стоять при комнатной температуре в течение двух недель, а затем прессуют для выдавливания жидкого экстракта. В течение нескольких суток из водно-этанольного раствора выпадает преципитат. Водно-этанольный супернатант сливают с пастообразного преципитата. Через несколько дополнительных недель с использованием центрифуги преципитат далее концентрируют в полутвердое состояние. Эти влажные полутвердые вещества удаляют и нагревают до 50°С в течение 6-8 ч при перемешивании. Влажный объем полутвердых веществ уменьшают до приблизительно 40% от исходных влажных полутвердых веществ. Высушивание полутвердых веществ в карамелеобразное, подобное меду вещество дает выход приблизительно 16% от первоначальной массы влажного твердого вещества. Таким образом, использование 1000 мл влажного твердого вещества (которое составляет 40% от первоначального экстракта) дает выход приблизительно 170 мл густого, подобного сиропу карамелеобразного вещества. Продолжающееся нагревание и перемешивание концентрирует это вещество в заметно более сладкое вещество. Экстракт можно кристаллизовать, преобразовывать в порошок и использовать в качестве замены другим способам обработки. Жидкие, полутвердые и кристаллизованные формы имеют заметно сладкий вкус и могут считаться медицинским подобным леденцу веществом, полезным как пчелам, так и людям, для широкого множества применений.

Пример 4.

Экстракт мицелия получают путем экстракции плодовых тел или мицелия базидиомицетных грибов, включая Ganoderma resinaceum, в горячей воде (80-100°С) в течение нескольких часов и комбинируют с водным экстрактом комнатной температуры (10-30°С) мицелия Fomes fomentarius, Fomitopsis officinalis, Fomitopsis pinicola, Ganoderma resinaceum, Inonotus obliquus, Piptoporus betulinus, Trametes versicolor и/или Schizophyllum commune, выращенного на зерне или древесине. К этим водным экстрактам добавляют этанол для получения раствора с более чем 22% EtOH (этанол), предпочтительно 35-45% EtOH. После добавления этанола полисахариды преципитируются из раствора и оседают на дне сосуда для экстракции. После удаления супернатанта преципитированные полисахариды, обогащенные гликозидами, гликопротеинами и другими подобными нектару питательными веществами, собирают и на

- 24 032759 гревают при 50-70°С в течение нескольких часов, что приводит к образованию сладкого остатка, привлекательного и полезного для пчел. Альтернативно супернатант можно хранить в течение нескольких суток, что дополнительно обеспечивает полезные преципитированные полисахариды. Эти преципитаты содержат комплексные сахара, противовирусные соединения, антибактериальные соединения, активирующие цитохром P450 кумаровые кислоты и кумарины, и их можно комбинировать с другими ингредиентами, используемыми в питьевой воде, лепешках из пыльцы, прополисе, пчелином воске, спреях или в любой системе доставки, при помощи которой пчелы могут контактировать с этими преципитатами, что помогает пчелам преодолеть стрессовые факторы, ассоциированные с синдромом краха колонии.

Пример 5.

Экстракт мицелия, полученный путем экстракции плодовых тел или мицелия базидиомицетных грибов, в том числе Ganoderma resinaceum, сначала помещают в 100% этанол (соотношение 1:1 по массе) на 1-7 суток. После дренирования этанола грибную или мицелиальную выжимку погружают в горячую воду (80-100°С) на несколько часов и комбинируют с полученным помещением в воду комнатной температуры (10-30°С) экстрактом мицелия Fomes fomentarius, Fomitopsis officinalis, Fomitopsis pinicola, Ganoderma resinaceum, Inonotus obliquus, Piptoporus betulinus, Trametes versicolor и/или Schizophyllum commune, выращенного на зерне или древесине. К этим водным экстрактам добавляют экстракты в этаноле, описанные выше, для получения общего комбинированного раствора с более чем 22% EtOH, предпочтительно 35-45% EtOH. После добавления этанольной фракции полисахариды преципитируют из раствора и оседают на дне емкости для экстракции. П-кумаровая кислота, являющаяся более растворимой в этаноле, чем в воде, в большем количестве содержится в супернатанте, экстрагированном этанолом (этанольный супернатант с концентрированными п-кумаровыми кислотами является резервуаром полезных для пчел кодирующих P450 соединений). Этот водно-этанольный супернатант можно хранить в течение нескольких суток, что далее приводит к смеси полисахаридов, в которой пропорционально больше пкумаровой кислоты, чем во фракциях горячей воды отдельно. Преципитат также содержит п-кумаровые кислоты и, кроме того, другие питательные вещества, которые можно использовать для кормления пчел. Эти обогащенные п-кумаровой кислотой преципитаты также содержат комплексные сахара, противовирусные соединения, антибактериальные соединения и семейства кумаринов и могут быть комбинированы с другими ингредиентами, такими как растворимые в воде полисахариды грибов, кукурузный сироп или сахара, используемые для подслащения питьевой воды, или, кроме того, включаемые в качестве ингредиента в лепешки из пыльцы, прополис, пчелиный воск, спреи или в любую систему доставки, с помощью которой пчелы контактируют с этими преципитатами, помогая пчелам преодолеть стрессовые факторы, ассоциированные с синдромом краха колонии.

Пример 6.

Для каждого типа экстракта мицелия (вида грибов) медоносных пчел смешанного возраста из одного улья собирали в один день и распределяли случайным образом в 16 клеток приблизительно по 100 пчел в каждой. Каждый набор из 16 клеток состоял из четырех контрольных клеток (кормление сахарным сиропом), четырех клеток низкой концентрации (кормление экстрактом мицелия в сахарном сиропе в концентрации 0,1% об./об.), четырех клеток средней концентрации (кормление экстрактом мицелия в сахарном сиропе при 1% об./об.) и четырех клеток высокой концентрации (кормление экстрактом мицелия в сахарном сиропе при 10% об./об.). В каждой группе из четырех клеток три клетки использовали для тестов продолжительности жизни и оставшуюся клетку реплики использовали для исследования общего количества вирусных частиц. Отдельный эксперимент проводили для оценки эффекта экстрактов грибов на конкретные типы вирусов.