Снижение общего уровня вируса у пчел

Для исследования противовирусных свойств каждого типа экстракта мицелия (вида грибов) медоносных пчел смешанного возраста из одного улья собирали в один день и распределяли случайным образом в четыре клетки приблизительно по 100 пчел в каждой. Это испытание проводили параллельно испытанию продолжительности жизни, описанному выше, с использованием пчел из тех же ульев на протяжении того же временного интервала. Набор клеток для каждого вида грибов состоял из контрольной клетки (кормление сахарным сиропом), клетки низкой концентрации (кормление экстрактом мицелия в сахарном сиропе в концентрации 0,1% масс./об.), клетки средней концентрации (кормление экстрактом мицелия в сахарном сиропе в концентрации 1% об./об.) и клетки высокой концентрации (кормление экстрактом мицелия в сахарном сиропе в концентрации 10% об./об.).

Образцы пчел извлекали из клеток и замораживали на 0 сутки, 7 сутки и 14 сутки. Анализ общего количества вирусных частиц, безотносительно вида вирусов, проводил Dr. David Wick из BVS, Inc. с использованием технологии IVDS; см. патенты США № 8524155, 8309029, 8146446, 8021884, 7850908, 7250138, 6491872, 6485686 и 6051189 (все Charles Wick) и Charles H. Wick, Integrated Virus Detection, CRC Press (2014). Для анализа каждого образца 6,0 г пчел смешивали с 100 мл воды, очищенной обратным осмосом (RO) и подвергали грубой фильтрации через двухслойную марлю. Затем субобразец объемом 90 мл центрифугировали в течение 60 мин при 20000^xg. Супернатант выделяли и подвергали ультрафильтрации через фильтрационную систему с полыми волокнами с порогом 500000 Да, а затем промывали 200 мл RO воды и уменьшали в объеме до приблизительно 2 мл. Раствор подготавливали для анализа с использованием интегрированной системы обнаружения вирусов (IVDS) с использованием разведения 1:10 ацетатом аммония (АА). Каждый образец фильтровали через 20 мкм бумагу w-41 или 0,45 мкм фильтр PTFE. Образцы сканировали пять раз с использованием IVDS и регистрировали средние уровни вируса.

Как продемонстрировано на фиг. 6, 7, 8 и 9, общая вирусная нагрузка на пчел, которых кормили экстрактами различных видов грибов, была снижена, причем уменьшение уровня вирусов зависело как от вида грибов, так и от концентрации, употребляемой пчелами. На фиг. 6 представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая общий уровень вирусных частиц у пчел, которым давали экстракты мицелия Inonotus obliquus (0,1%, 1% и 10%, как соответственно показано точечной, пунктирной и двойной пунктирной линиями) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром (показано сплошной линией) в нулевой момент времени, через одну неделю и две недели. На фиг. 7 представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая общий уровень вирусных частиц у пчел, которым давали экстракты мицелия Ganoderma resinaceum (0,1%, 1% и 10%, как соответственно показано точечной, пунктирной и двойной пунктирной линиями) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром (показано сплошной линией) в нулевой момент времени, через одну неделю и две недели. На фиг. 8 представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая общий уровень вирусных частиц у пчел, которым давали экстракты мицелия Fomitopsis pinicola (0,1%, 1% и 10%, как соответственно показано точечной, пунктирной и двойной пунктирной линиями) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром (показано сплошной линией) в нулевой момент времени и через одну неделю. На фиг. 9 представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая общий уровень вирусных частиц у пчел, которым давали экстракты мицелия Schizophyllum commune (0,1%, 1% и 10%, как соответственно показано точечной, пунктирной и двойной пунктирной линиями) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром (показано сплошной линией) в нулевой момент времени и через две недели. Эти и сходные фигуры можно использовать при применении настоящего

- 27 032759 изобретения на практике для демонстрации эффекта изобретению на здоровье пчел. При применении настоящего изобретения на практике большинство, но не все из видов, которые обеспечивали увеличенную продолжительность жизни, также снижали вирусную нагрузку. Это подразумевает, что снижение уровня вирусов может способствовать увеличению продолжительности жизни, однако это улучшение продолжительности жизни можно было наблюдать без снижения уровня вирусов вследствие других благоприятных аспектов изобретения, таких как общая стимуляция иммунитета роя и антбиотическая активность против невирусных патогенов, таких как Nosema. При применении на практике настоящего изобретения возможно множество причин увеличения продолжительности жизни, поскольку различные виды грибов, по-видимому, имеют различные и специфические способы действия против различных патогенов пчел, как описано ниже в качестве неограничивающего примера.

Снижение общей вирусной нагрузки можно измерять при применении настоящего изобретения на практике путем вычисления разности в обнаруженном вирусе между пчелами, к которым применяли изобретение, и пчелами, которых не подвергали воздействию настоящего изобретения. Один такой способ количественного определения этой разности основан на средней величине функции:

где величины a и b обозначают исходные и конечные сутки, на протяжении которых измеряли эффект изобретения, и f(x) обозначает уровень обнаружения вируса в зависимости от времени взятия образца. Процентное отличие этих величин на протяжении указанного временного интервала соответствует среднему процентному снижению уровня вируса, достигнутому посредством применения настоящего изобретения на практике на протяжении указанного временного интервала. Другие способы измерения отличий в уровнях вирусов с течением времени, включая процентное отличие в отдельные моменты времени взятия образцов, среднее отличие и статистические способы, такие как анализ Каплана-Мейера, являются приемлемыми альтернативами при применении настоящего изобретения на практике и включены в качестве ссылок. С использованием способа, описанного выше, для измерения отличия между уровнями вирусов на протяжении различных временных интервалов автор изобретения определяет снижение вируса как являющееся осуществлением настоящего изобретения. См. табл. I, Среднее процентное снижение общей вирусной нагрузки.

В таблице представлено отличие между средними величинами % выживших пчел при оценке в различные временные интервалы. Это отличие приведено не в качестве числовой разности этих процентов, а вместо этого в качестве процентного снижения:

% снижение вирусной нагрузки _ средний титр вирусов_{кормление экстрактом грибов} - средний титр вирусов_{контродь} средний титр вирусов_{контроль}

Виды грибов/специфичность к заболеваниям.

Конкретные типы экстракта мицелия (вид грибов) при кормлении пчел смешанного возраста могут снизить уровень этиологических факторов заболеваний, таких как вирусные частицы, видоспецифическим образом. Этот вариант осуществления изобретения был продемонстрирован путем кормления экстрактами грибов пчел в клетках и измерения уровней конкретных типов вирусов у пчел с течением времени. Для этого анализа собирали пчел смешенного возраста из одного улья в один день и равномерно распределяли случайным образом в 12 клеток. В четырех клетках проводили кормление экстрактом мицелия Ganoderma lucidum var. resinaceum в концентрации 1% об./об. в сахарном сиропе, в четырех клетках проводили кормление экстрактом мицелия Inonotus obliquus в концентрации 1% об./об. в сахарном сиропе и четыре клетки использовали в качестве контроля и в них проводили кормление только сахарным сиропом.

Образцы пчел извлекали из клетки и замораживали на 0 сутки, 3 сутки, 7 сутки и 14 сутки. Пчелотправляли Dr. Yanping (Judy) Chen в United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service дляанализасиспользованиемОТ-ПЦРвреальномвремени, какописанов Chen et al., Quantitative realtime reverse transcription-PCR analysis of Deformed Wing Virus infection in the honeybee (Apis mellifera L.), Appl. Environ. Microbiol., Vol. 71 (2005), p. 436-441 и Khongphinitbunjong et al., Differential viral levels and immune gene expression in three stocks of Apis mellifera induced by different numbers of Varroa destructor, Journal of Insect Physiology, Vol. 72 (2015), p. 28-34.

В этом анализе количественно определяли уровни вируса на основе накопления флуоресцентного сигнала по мере того, как ДНК вируса амплифицировалась в реакции ПНР. Порог числа циклов определяют как количество циклов, требуемое для того, чтобы флуоресцентный сигнал превысил фоновый уровень флуоресценции. Уровни порога числа циклов, таким образом, обратно пропорциональны количеству вирусной нуклеиновой кислоты-мишени (например, титру вируса) в образце (т.е. чем ниже уровень СТ, тем больше количество нуклеиновой кислоты-мишени в образце). Как продемонстрировано на фиг. 10, у пчел, которых кормили экстрактами мицелия Ganoderma lucidum var. resinaceum и Inonotus obliquus, происходило предотвращение увеличения уровней вируса черных маточников (как количественно определяли на основе порога числа циклов). См. фиг. 10, линейный график, демонстрирующий порог числа циклов для

- 28 032759 вируса черных маточников с течением времени в контрольной популяции, которую кормили только водой с сахаром (показано сплошной линией 111), по сравнению с пчелами, которым давали экстракты мицелия Inonotus obliquus (1%) (показано пунктирной линией 112) и Ganoderma resinaceum (1%) (показано пунктирной линией 113) с водой с сахаром. Напротив, те же экстракты не имели значительного эффекта на уровни вируса деформации крыла. См. фиг. 11, линейный график, демонстрирующий порог числа циклов для вируса деформации крыла с течением времени в контрольной популяции, которую кормили только водой с сахаром (показано сплошной линией 121) и у пчел, которым давали экстракты мицелия Inonotus obliquus (1%) (показано точечной линией 122) и Ganoderma resinaceum (1%) (показано пунктирной линией 113) с водой с сахаром.

Этот пример экстракта вида грибов, обладающего специфичностью против одного вирусного патогена, но не против других, является противовирусным вариантом осуществления изобретения. Также он подтверждает довод, что конкретные композиции экстрактов грибов аналогично могут быть специфичными к другим патогенам пчел (которые снижают продолжительность жизни), таким как Nosema и бактерии, и/или могут, главным образом, активировать метаболические, иммунные и детоксикационные системы пчел. Такие эффекты против невирусных патогенов или эффекты общего усиления метаболизма и иммунитета могут быть ответственными за те случаи, когда продолжительность жизни повышалась, однако вирусная нагрузка оставалась неизменной.