Повышение продолжительности жизни пчел

Для исследования продолжительности жизни (выживаемости), каждые сутки проводили мониторинг каждой реплики (три клетки для каждой концентрации в корме и контрольная группа) и подсчитывали погибших пчел. Для каждых суток эксперимента общее количество пчел, которые погибли в этот день, вносили в таблицу для каждой клетки реплики для каждого экстракта грибов и для контрольных групп. Затем эти таблицы с погибшими пчелами за каждые сутки использовали для вычисления процента пчел, которые все еще были живыми на каждые сутки эксперимента, от исходного количества. Затем, исходя из данных от трех клеток реплики для каждого экстракта грибов и для контрольной группы, вычисляли процентную частоту выживаемости.

Графики выживаемости строили с использованием времени, измеренного в сутках, в качестве независимой переменной (ось х), и среднего процента пчел, выживших в любой момент времени в эксперименте, в качестве зависимой переменной (ось у); на графиках продолжительности жизни показан % выживших особей от первоначальной популяции в различные моменты времени (см. фиг. 1-4). На фиг. 1 представлен линейный график, демонстрирующий процентную выживаемость пчел с течением времени, которым давали экстракты мицелия Inonotus obliquus (0,1%, 1% и 10%, как показано соответственно точечной, пунктирной и двойной пунктирной линиями) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром (показана сплошной линией). На фиг. 2 представлен линейный график, демонстрирующий процентную выживаемость пчел с течением времени, которым давали экстракты мицелия Ganoderma resinaceum (0,1%, 1% и 10%, как показано соответственно точеч

- 25 032759 ной, пунктирной и двойной пунктирной линиями) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром (показана сплошной линией). На фиг. 3 представлен линейный график, демонстрирующий процентную выживаемость пчел с течением времени, которым давали экстракты мицелия Fomitopsis pinicola (0,1%, 1% и 10%, как показано соответственно точечной, пунктирной и двойной пунктирной линиями) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром (показана сплошной линией). На фиг. 4 представлен линейный график, демонстрирующий процентную выживаемость пчел с течением времени, которым давали экстракты мицелия Fomes fomentarius (1%, показано светлой сплошной линией) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром (показано темной сплошной линией). Эти и сходные подходы можно использовать при применения настоящего изобретения на практике для демонстрации эффекта изобретения на здоровье и продолжительность жизни пчел. На фигурах представлены средние значения в экспериментах; планки стандартной погрешности были удалены для ясности.

Некоторые, но не все, из результатов этих предварительных экспериментов были статистически значимыми; после продолжения экспериментов с большим количеством реплик ожидаются улучшенные результаты. Статистическую значимость оценивали с использованием оценки выживаемости КапланаМейера (ограничение по продукту), проведенной с использованием статистического программного обеспечения для исследований JMP® от SAS Institute, Inc. См. фиг. 5, график оценки выживаемости КапланаМейера (ограничение по продукту), демонстрирующий долю пчел, выживших с течением времени в сутках, когда им давали экстракты мицелия Fomes fomentarius (0,1%, 1% и 10%, как соответственно показано точечной, пунктирной и двойной пунктирной линиями) с водой с сахаром по сравнению с контрольной популяцией, которую кормили только водой с сахаром (показано сплошной линией). Этот анализ сравнивал среднее время выживания для группы введения со средним временем выживания для контроля (кормление только водой с сахаром), и в нем использовался критерий Вилкоксона для оценки того, отличалась ли выживаемость статистически от случайного варьирования времени выживания пчел. На фиг. 5 иллюстрируется этот вариант осуществления изобретения. В этом анализе композиция Fomes fomentarius при кормлении в концентрации 1% об./об., повышала среднюю выживаемость пчел на 9,7% (р<0,0006).

Как продемонстрировано на фиг. 1-5, продолжительность жизни пчел, которых кормили экстрактами различных видов грибов, повышалась, причем увеличение продолжительности жизни зависело как от вида гриба, так и от концентрации, употребляемой пчелами. При применении настоящего изобретения на практике в большинстве случаев это увеличение продолжительности жизни, возможно, является следствием снижения вирусной нагрузки (как описано ниже), но также обуславливалось другими аспектами изобретения в случаях, когда продолжительность жизни повышалась, однако количество вирусов не снижалось.

Увеличение продолжительности жизни может быть продемонстрировано при применении настоящего изобретения на практике с использованием графиков выживаемости, таких как, но не ограничиваясь ими, графики, описанные выше. Увеличение продолжительности жизни можно численно измерять при применении настоящего изобретения на практике посредством вычисления отличий в выживаемости. Один такой способ основан на средней величине функции:

Г^ь favg = _h,. J где величины a и b обозначают исходные и конечные сутки, на протяжении которых измеряли эффект изобретения, и f(x) обозначает функцию графика выживаемости, как описано выше. Отличие этих чисел на протяжении указанного временного интервала соответствует среднему процентному увеличению продолжительности жизни, достигаемому путем применения настоящего изобретения на практике по изобретению на протяжении указанного временного интервала.

Другие способы измерения отличий в продолжительности жизни, выживаемости или увеличении популяции, включая статистические способы, такие как анализ Каплана-Мейера, способ НельсонаАалена и другие способы, которые известны специалистам в данной области, являются альтернативами при применении настоящего изобретения на практике.

Аналогично для применения настоящего изобретения практике можно использовать различные количественные способы оценки количеств вирусов у пчел, включая полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и ОТ-ПЦР в реальном времени на основе амплификации кДНК способом ПЦР, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), включая как обычный, так и сэндвичELISA с различными блокирующими агентами, первичными/вторичными антителами, репортерными ферментами и растворами их специфических колориметрических субстратов для обнаружения и количественного определения, мультиплексные микрочипы с использованием молекулярных зондов для различных РНК-мишеней или ДНК-мишеней AGID (иммунодиффузия в агарозном геле), серологические способы на основе профилей белков или поликлональных и моноклональных антител и широкое множество других способов молекулярной биологии, таких как технологии высокопроизводительного секвенирования, технологии секвенирования на основе пирофосфатов, секвенирование по методу Сэнгера (также

- 26 032759 называемое способом терминации цепи) и интегрированные системы обнаружения вирусов (IVDS). См., например, De Miranda, Diagnostic techniques for virus detection in honey bees, Aubert et al. (Eds.), Virology and the honey bee, EEC Publications (2008), pp. 121-232 и Evans et al., Standard methodologies for molecular research in Apis mellifera, Journal of Apicultural Research 52(4) (2013).

С использованием этого способа для измерения отличий в продолжительности жизни, автор изобретения определяет улучшение продолжительности жизни, как являющееся осуществлением настоящего изобретения. См. табл. II, Среднее процентное увеличение продолжительности жизни пчел. В таблице представлено отличие между средними величинами % выживших пчел при оценке на протяжении различных временных интервалов. Это отличие приведено в качестве числовой разности этих процентов причем средний процент выживших на протяжении различных временных интервалов вычисляли, как описано ранее:

Увеличение продолжительности жизни=средний % выживших_при кормлении экстрактом грибов ~ СрвДНИИ 'б ВЫЖИВШИХконтроль

Увеличение продолжительности жизни увеличивает количество пчелиных дней, когда рабочие или другие классы пчел доступны для сбора пыльцы и поддержания улья и выполнения другой работы, при этом улучшение состояния здоровья и увеличение выживаемости особей приводит к улучшению здоровья и выживаемости колонии.