Культивирование. Листерии — факультативные анаэробы, температурный диапазон 4-45° С, оптимум — 30-37° С; оптимальный рН питательных сред 7,2-7,4, диапазон рН 5,6-9,6. С целью выявления способности к образованию жгутиков культивирование необходимо проводить при 20-25° С. Все штаммы листерий растут на средах с 10% NaCl, на агаре Мак-Конки, в присутствии 0,025% ацетата таллия, 0,01 хлорида 2,3, 5-трифенилтетразолия, 0,04% теллурита таллия, но не растут в присутствии цианида калия и 0,02% азида натрия.
Исследуемый материал высевают на МПА, МПБ, печеночный агар и бульон с добавлением 1% глюкозы и 2-3% глицерина, кровяной агар. Из паренхиматозных органов делают обильные множественные посевы или предварительно готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе (1:5), которую высевают на среду. У абортированных плодов посевы производят из органов и содержимого желудка. Используя способность листерий к размножению при низких температурах, параллельно с обычными посевами можно сохранять материал при 4° С в холодильнике (в 30%-ном глицерине) в течение 30 дней и при отрицательных первичных посевах через каждые 10 дней из материала делают повторные посевы. Кроме того, используя это же свойство листерий, можно производить высевы из паренхиматозных органов, головного мозга на питательный бульон и посевы инкубировать при 4° С в течение 1-6 месяцев с периодическим их просмотром и высевом на плотные среды. В жидкие питательные среды в этом случае рекомендуется добавлять для подавления роста сопутствующей микрофлоры 15-25 ЕД/мл полимиксина.
|
|
Молоко, истечения из половых органов и другой контаминированный материал высевают на селективные среды: среда с теллуритом калия и флоримицином или полимиксином, среды с теллуритом калия, МПБ с 10% натрия хлорида. Кроме того, может быть использована среда с ацетатом таллия и налидиксовой кислотой, среда с налидиксовой кислотой, тиоцинатом калия, трипафлавином и налидиксовой кислотой. При использовании двух первых сред 1-2 мл исследуемого материала засевают в две колбы со 100-200 мл среды обогащения. Посевы в одном сосуде культивируют при 37° С, в другом при 4° С. Из первой колбы ежедневно, на протяжении 7 суток, отсевают 0,1 мл на плотную среду, инкубируют и исследуют в косопроходящем пучке света характер выросших колоний. Образец, инкубируемый при 4° С, исследуют аналогичным образом через каждые 7 дней в течение 2 месяцев. При посеве на агар с трипафлавином и налидиксовой кислотой инкубирование проводят при 37° С в течение 24-48 часов.
Для исследования контаминированного материала (слизь влагалищная, из матки, фекалии и др.) помещают в пробирки с 5 мл бульона для листерий, из тканей и фекалий готовят в бульоне 10%-ную суспензию. Бульон с материалом хранят при 4° С. В первые четыре недели посевы производят еженедельно, путем внесения 0,2 мл суспензии в пробирку с
5 мл бульона для листерий, содержащего тиацинат калия и инкубируют 48 часов при 25° С. Для получения изолированных колоний производят посев бактериологической петлей из верхней части суспензии на селективные плотные среды для листерий.
|
|
Рекомендуют высевать контаминированный материал на МПБ с 0,01% таллурита калия и 15 ЕД/мл флоримицина с последующей отвивкой культуры на МПА с 0,004% налидиксовой кислоты или первоначально посевы делать на обычный МПБ и затем отвивать культуру на МПА с 3,75% роданистого калия или МПА с 0,01% теллурита калия и флоримицином. Посевы инкубируют при 37° С в обычной атмосфере. Просматривают посевы ежедневно в первые 3-4 дня, наблюдая до двух недель. Культивирование посевов при 5-10% СО2 обеспечивает лучший рост листерий. Широкое применение для изоляции листерий получили Оксфорд-агар и PALCAM-агар.
Следует отметить, что метод холодового обогащения при 4° С из-за длительности инкубирования посевов неудобен, несмотря на его высокую эффективность и обычно рекомендуется проводить инкубацию первичных посевов в жидкой накопительной среде при 30° С в течение 24-48 часов с последующим высевом на селективный агар. Жидкая среда обогащения в качестве селективных факторов содержит акрифлавин, налидиксовую кислоту, циклогексимид.
Характер роста L. monocytogenes на питательных средах. В МПБ рост возбудителя в первые сутки сопровождается легким равномерным помутнением среды. Через 4-7 суток на дне пробирки образуется слизистый осадок. Диссоциированные культуры могут вызывать образование на поверхности среды пленки, хлопьевидный или крошковидный осадок на дне пробирки.
На плотных средах первичные посевы обязательно просматривают с интервалом в несколько дней в косопроходящем пучке света. Колонии листерий мелкие, росинчатые, круглые, выпуклые, прозрачные, диаметром 0,2-3 мм, с голубоватым оттенком и мелкозернистой структурой
(S-форма), в проходящем свете имеют сине-зеленый цвет. На кровяном (овечьем) агаре образуется узкая зона гемолиза. Могут наблюдаться R- и SR-формы. Колонии R-формы нередко состоят из нитевидных клеток, гемолитическая активность выражена слабо. На Оксфорд-агаре колонии листерий имеют черный цвет и окружены черным ореолом. На PALCAM-arape колонии серо-зеленые с черным вогнутым центром, черным ореолом на красном фоне агара. На полужидком агаре (0,2%) возбудитель растет вначале по уколу в виде серо-белого хлопьевидного штыря с последующим распространением по всему столбику питательной среды. Смешанные культуры очищают дробным рассевом на плотные питательные среды или путем заражения белых мышей.
Морфология листерий в культуре. Морфологию клеток изучают в препаратах, окрашенных по методу Грама, а также проводят идентификацию выделенной культуры методом флуоресцирующих антител. В молодых культурах преобладают клетки палочковидной формы, в старых могут наблюдаться нитевидные клетки, в выращенных при 37° С — кокковидной формы. В 2-5-дневных культурах часть клеток начинает окрашиваться грамотрицательно.
Идентификация листерий на уровне рода и вида. Виды рода Listeria сходны по ряду признаков с бактериями, объединенными в условную, не имеющую таксономического значения, группу «Грамположительные неспорообразующие палочки правильной формы». И на первом этапе исследования нередко приходится дифференцировать листерий от бактерий родов Erysipelothrix, Lactobacillus, Kurthia, Caryophanon, Brochothrix, Renibacterium, входящих в данную группу. Для этой цели необходимо после определения морфологии и тинкториальных свойств клеток провести культивирование идентифицируемой культуры в аэробных и анаэробных условиях и определить ее способность выделять каталазу. По типу дыхания и каталазной активности все бактерии данной группы можно разбить на три подгруппы: аэробы — виды родов Kurthia, Caryophanon, Renibacterium; каталазопозитивные факультативные анаэробы или микроаэрофилы — виды родов Listeria и Brochothrix; каталазонегативные факультативные анаэробы — виды родов Erysipelothrix, Lactobacillus. Для дифференциации листерий от лактобацилл дополнительно культуру можно высеять на МРС-среду, на которой в отличие от молочнокислых бактерий листерий не растут или растут очень плохо.
|
|
В качестве дополнительных тестов для дифференциации листерий от эризипелотриксов рекомендуется посев испытуемой культуры (бульонная, смыв агаровой) в количестве 2-4 капель в индикаторные среды: с лакмусом, нейтральротом в смеси с метиленовым синим, метилротом, конгоротом амидочерным. Пробирки после встряхивания инкубируют вместе с незасеянными контрольными пробирками при 37° С. Результат учитывают через 3, 6, 24 и 48 часов. Листерий через 3-6 часов обесцвечивают среду с нейтральротом и метиленовым синим, лакмусом. Встряхивать пробирки нельзя, так как цвет может частично восстановиться. Среда с метилротом обесцвечивается через 3-6 часов, но восстановления среды не наблюдается. Среды с конгоротом и амидочерным обесцвечиваются позднее (6-48 часов), и цвет среды не восстанавливается. Эризипелотриксы указанные среды не обесцвечивают.
Так же исследуют способность культуры расщеплять салицин и эскулин. Листерий разлагают с образованием кислоты оба субстрата. В свою очередь дифференциацию родов Listeria и Brochothrix проводят по наличию жгутиков и способности к росту при 37° С. Для этого выращивают культуру в оптимальной питательной среде при 20-25° С и 37° С. Листерий обладают подвижностью при 20-25° С, но неподвижны при 37° С. Бактерии рода Brochothris не растут при 37° С и не образуют жгутиков при обоих температурных режимах. В косопроходящем пучке света колонии наиболее сходного с листериями вида В. thormosphacta отличаются от колоний листерий. Кроме того, В. thormosphacta не гидролизует гиппурат и не образует кислоту из многих Сахаров, расщепляемых листериями.
|
|
В конечном итоге для дальнейшего изучения отбирают культуры бактерий с типичными для листерий культурально-морфологическими, тинкториальными свойствами, являющиеся подвижными при 20-25° С, каталазоположительными.
Важным таксономическим признаком как для родовой, так и для видовой идентификации листерий является обнаружение в ходе исследования у культуры патогенных свойств. При видовой идентификации из-за высокого фенотипического сходства между штаммами L. monocytogenes,
L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri и L. welshimori исследуемые штаммы в первую очередь проверяют на патогенность для мышей и гемолитическую активность.
Критерии дифференциации отдельных видов листерий по ферментативным свойствам и патогенности представлены в таблице 1. У исследуемой культуры необходимо определить гемолитические свойства посевом на кровяной агар, скрытую гемолитическую активность в САМР-тесте со S. aureus или R. equi, гидролиз гиппурата, восстановление нитрата, образование кислоты из маннита, L-метил-D-маннозида, L-рамнозы, D-ксилозы и патогенность для белых мышей.
Целесообразно использование микротеста системы API Listeria (BioMericux) и ее аналогов. Рекомендуется для изучения ферментативных свойств делать посев бульонной культуры на среды с глюкозой, маль тозой, маннитом, салицином, трегалазой, дульцитом, инулином, раффиназой. Посевы инкубируют при 37°С в течение 10 суток. Для листерий (L. monocytogenes) характерно расщепление с образованием кислоты без газа глюкозы, мальтозы, дульцита, раффинозы, рамнозы.
Идентификация листерий при помощи бактериофагов. Используют два фага (L 2 А и L 4A), позволяющих идентифицировать до 85% штаммов L. monocytogenes. Лиофилизированные фаги растворяют в МПБ и используют в течение 5-10 суток при условии хранения в холодильнике (2-6° С). Методика их применения в соответствии с рекомендациями авторов следующая. Испытуемую культуру выращивают 16-18 часов при 37° С, затем засевают в МПБ с глюкозой (0,5%). Доза культуры должна быть такой, чтобы после посева среда опалесцировала. Далее подращивают 4 часа при 37° С, высевают газоном на 2%-ный подсушенный МПА в чашках Петри, выдерживают в термостате при 37° С в течение 1-1,5 часов (крышка должна быть слегка приоткрытой).