Тема: Реакції з використанням мічених антигенів і антитіл

1.3. Актуальність теми.

Широке використання імунофлюоресцентного, радіоімунного та імуноферментного методів обумовлена високою чутливістю, можливістю виявлення широкого кола біологічних речовин.

1.2. Цілі вивчення теми.

1.2.1. Мета загальна.

Засвоїти принципи, механізми та призначення імунофлюоресцентного, радіоімунного та імуноферментного методів в діагностиці.

1.2.2. Мета конкретна.

Оволодіти технікою постановки імунофлюоресцентного, радіоімунного та імуноферментного методу. Вміти інтерпретирувати результати прямого та непрямого імунофлюоресцентного методу, а також імуноферментного аналізу (ІФА).

1.3. Забезпечення вихідного рівня знань-умінь:

1. Корпускулярні та розчинні антигени.

2. Принципи серологічної діагностики інфекційних захворювань.

3. Серологічна ідентифікація збудників, як один з основних методів дослідження мікроорганізмів.

1.3. Тести на вихідний рівень знань-умінь:

1.3.1. Назвіть специфічні та неспецифічні фактори гуморального імунітету:

A – еритрін

B – С-реактивний білок

C – тромбоцитоактивуючий фактор

D – інтерлейкін

E – гамаглобуліни

F – лейкоцити

G – простогландіни

Правильна відповідь A, B, C, D, E, G.

1.4. Зміст заняття.

Реакції, в яких приймають участь мічені антигени або антитіла (імунофлюоресценції, радіоімунний та імуноферментний методи) по своїй чутливості перевершує всі серологічні реакції.

Реакція імунофлюоресценції Кунса (РІФ) дозволяє виявити мікробні антигени в патологічному матеріалі з допомогою мічених флюорохромами діагностичних сироваток. При наявності специфічних антигенів для діагностичної сироватки в люмінісцентному мікроскопі виявляють світінення (прямий метод).

В непрямому методі спочатку антиген зв’язують з звичайним антигеном, а потім цей комплекс обробляють міченим антиглобуліном, який з’єднується з ним. Утворюється комплекс легко виявляють по світінню в люмінісцентному мікроскопі.

В радіоімунному методі (РІМ) використовують очищенні і концентровані антигени та антитіла, мічені радіоізотопом. РІМ використовують для виявлення як антигенів, так і антитіл. Для виявлення антитіл до досліджуваної сироватки додають певну кількість міченого антигену. Для виявлення антигену до досліджує мого матеріалу додають специфічну діагностичну сироватку, а потім – гомологічний мічений антиген. Якщо мічений антиген залишається вільним – реакція позитивна.

Імуноферментний метод (ІФМ.) використовується для виявлення антигенів і антитіл з застосуванням твердофазних носіїв (полістеролові або полівінілові пластини). Для виявлення антитіл використовують пластини, на дні яких знаходяться фіксовані антигени і додають досліджувану сироватку. Потім (після промивки буфером) обробляють антисироваткою (антиглобуліном), міченою ферментом, для виявлення якого використовують Н₂О₂ та індикатор.

Для виявлення антигену використовують пластини з діагностичною сироваткою, а потім (після промивки буфером) обробляють антисироваткою міченої ферментом, виявлення якого проводять з використанням Н₂О₂ та індикатора.

ІФМ знаходить широке використання в діагностиці вірусних інфекційних захворювань.

1.4.1. Граф логічної структури реакції імунофлюоресценції (РІФ).

Досліджуваний матеріал: патологічний матеріал, який містить бактеріальні або вірусні антигени.

Постановка прямої РІФ (метод Кунса) з діагностичними специфічними флюоресцуючими сироватками.

Постановка непрямої РІФ супроводжується використанням флюоресцуючої антиглобулінової сироватки, яка містить антитіла тільки проти кролячих глобулінів.

2. Граф логічної структури імуноферментного методу (ІФМ).

Постановка ІФМ з метою виявлення антигенів або антитіл з використанням пластикових (полістиролових) панелей з адсорбованими на дні лунок антитіл або антигенів.

1.4.2. Перелік теоретичних питань:

1. Імунофлюоресцентний метод, феномени, які лежать в його основі.

2. Методичні варіанти реакції імунофлюоресценції (РІФ): прямий та непрямий методи Кунса.

3. Техніка постановки і діагностичне використання РІФ.

4. Радіоімунологічний аналіз (РІА), його принцип і призначення.

5. Імуноферментний аналіз (ІФА). Твердофазний імуноферментний метод. Його принцип та механізм взаємодії інгредієнтів.

6. Імуноблотінг. Етапи дослідження.

7. Використання ІФА та імуноблотінга в діагностиці інфекційних захворювань.

1.4.3. Джерела навчальної інформації.

Основна література:

К.Д.Пяткін, Ю.С.Кривошеїн. Мікробіологія, 1982, с.182

К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, 1980, с.204

В.Д.Тимаков. Микробиология, 1983, с.223-225

А.И.Коротяев, С.А.Бабич. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, Санкт-Петергбург, 2002, с.233

И.Л.Дикий, И.Ю.Халупяк, Н.Е.Шевелева, М.Ю.Стегний. Микробиология, Харьков, 1999, с.116-118

О.І.Клименюк, І.О.Ситник, М.С.Творко, В.П.Широбоків. Практична мікробіологія, Тернопіль, 2004, с.145-146

Л.Б.Борисов. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, М., 1984, с.112-115

Ю.С.Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии и диагностике инфекционных болезней, 1986

Додаткова література:

Словник по мікробіології, вірусології, імунології та інфекційним захворюванням. Заг. ред. проф. Палій Г.К., 2004, с.59-60, 119

Посібник з медичної вірусології. Заг. ред. В.М.Гиріна, К., 1995, с.99-110

1.5. Орієнтовна основа дії (ООД)

1. Використання ІФМ для виявлення антигенів та антитіл:

Визначення антитіл

Антиген (АГ) + Антитіла (АТ) (сироватка хворого)

		+ Антиглобулінова сироватка з ферментом (АГСФ)
	АГ + АТ

		+ Н2О2 + ортофенілдіамін (ОФД)
	АГ + АТ + АГСФ

відповідь

Визначення антигенів

Антитіла (АТ) + Антиген (АГ) (досліджуваний матеріал)

		+ Антиглобулінова сироватка з ферментом (АГСФ)
	АТ + АГ

		+ Н2О2 + ортофенілдіамін (ОФД)
	АТ + АГ + АГСФ

відповідь

2. Використання імунофлюоресцентного методу в діагностиці інфекційних захворювань:

Прямий метод (метод Кунса)

Антиген (АГ)	+	Антитіла (АТ) (специфічні флюоресцуючі)			Комплекс, що світиться
АГ + АТ

Непрямий метод

Антигени (АГ) + Антитіла (АТ)

		+ Антиглобулінова сироватка (АГС)
	АГ + АТ

		+ Комплекс, що світиться
	АГ + АТ + АГС

1.6. Система навчальних завдань.

1.6.1. Широке розповсюдження в вірусологічних дослідженнях одержав ІФА. З якою метою в діагностиці вірусних інфекцій використовується ІФА:

A – для виявлення специфічних антигенів

B – для виявлення специфічних антитіл

C – для визначення титру антитіл

D – для виділення вірусу

E – для визначення агрегірованих імунною сироваткою вібріонів

Правильна відповідь А, В

1.7. Короткі методичні вказівки для роботи студентів на лабораторному занятті.

1.7.1. Методика проведення заняття.

Ознайомитись з принципом постановки методу імуноферментного аналізу з метою виявлення специфічних антитіл в сироватці крові хворого. Для цього в лунки планшету з адсорбованим на дні антигеном вносять по 1 краплі досліджуваної сироватки і вміщують в термостат (37^оС). Потім промивають буферним розчином і вносять по 1 краплі мічених ферментом (пероксидазою хрону) анти видові (анти глобулінові) сироватки. Планшети вміщують в термостат (37^оС). Промивають лунки буферним розчином і додають по 1 краплі перекису водню та ортофенілдіаміну (ОФД). Вміщують в термостат до появи жовтого забарвлення в луночці з контрольною позитивною сироваткою.

Автор: асистент, кандидат медичних наук Коваленко І.М.