Определение каталазного числа крови.
Задание 1. Выявить действие каталазы.
Ход работы. В пробирку наливают 10-15 капель 3% раствора Н2О2 и прибавляют 1 каплю крови. Происходит бурное выделение кислорода: жидкость пенится, пена заполняет всю пробирку.
Задание 2. Определить каталазное число крови.
Принцип. Метод основан на определении количества гидроген пероксида, расщепленного ферментом за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного гидроген пероксида судят по разности количества КМnО4, израсходованного на титрование до и после действия каталазы: 2КМnО4 + 5Н2О2 + 3Н2SO4 → 5О2 + 2МnSО4 + K2SО4 + 8H2O.
Ход работы. В две колбы для титрования наливают по 1 мл разбавленной крови (1:1000) и прибавляют по 7 мл Н2О (дист.). Затем в исследуемую пробу прибавляют 2 мл 1% Н2О2, а в контрольную – 5 мл 10% раствора Н2SО4. Действие каталазы в кислой среде (в контрольной пробе) прекращается, поскольку она действует при рН=7,4. Обе пробы оставляют при комнатной температуре на 30 мин, затем наливают в исследуемую колбу 5 мл 10% Н2SO4, а в контрольную – 2 мл 1% раствора Н2О2. Содержимое каждой колбы титруют 0,1н раствором КМnО4 до слабо розовой окраски. Рассчитывают каталазное число (КЧ) по формуле:
КЧ (ед) = (А-В)×1,7, где А – количество 0,1н КМnО4, пошедшее на титрование контрольной пробы (мл); В – количество 0,1н КМnО4, пошедшее на титрование исследуемой пробы (мл); 1,7 – количество Н2О2, эквивалентное 1 мл 0,1н КМnО4 (мг) [1 мл 0,1н КМnО4 эквивалентен 1 мл 0,1н Н2О2].
Клинико-диагностическое значение. Каталаза (КФ 1.11.1.6) – геминовый фермент, который расщепляет гидроген пероксид на молекулярный кислород и воду. Показателем активности каталазы является каталазное число - количество мг гидроген пероксида, которое расщепляется одним микролитром крови за определенный промежуток времени. В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц, оно снижается при ряде заболеваний, сопровождающихся кахексией (рак, анемия, туберкулёз).
ЛИТЕРАТУРА
1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 122-136.
2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 157-174.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 256-286.
4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 172-228.
5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 305-316.
6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 264-280.
7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 199-212, 222-231.
8. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Кобилянська Л.І. та ін./ За ред. О.Я. Склярова.–К.:Здоров’я,2002.–С.67-88.
9. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 107-123.
ЗАНЯТИЕ 8
Тема: Основные закономерности обмена веществ. Общие пути катаболизма: окислительное декарбоксилирование пирувата, цикл трикарбоновых кислот (цикл Г. Кребса). Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц.
А.ктуальность. Окислительное декарбоксилирование пирувата и цикл трикарбоновых кислот (цикл Г. Кребса) являются общими метаболическими процессами, завершающими внутриклеточный распад белков, жиров и углеводов; они локализованы в митохондриях, обеспечивают бесперебойную доставку электронов и протонов в дыхательную цепь. Цикл Г. Кребса выполняет интегративную, водородгенерирующую, энергетическую и амфиболическую функции.Обмен веществ в клетке тесно связан с обменом энергии. Нарушение энергетического обмена является в большинстве случаев важным звеном патогенеза разных заболеваний, а его коррекция составляет основу их профилактики и лечения.
Цель. Выучить биохимические закономерности протекания обмена веществ и энергии; окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты; функционирование, механизмы регуляции и ключевую роль цикла трикарбоновых кислот в обмене веществ и энергии. Ознакомиться с определением активности сукцинатдегидрогеназы мышц и ее конкурентного ингибирования малоновой кислотой.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ
1. Общие представления о метаболизме и обмене энергии в организ-ме. Катаболические и анаболические пути метаболизма, их взаимосвязь.
2. Стадии катаболизма для экзогенных и эндогенных биомолекул в организме. Общие и специфические пути катаболизма. Конечные продукты катаболических путей в организме человека.
3. Внутриклеточная локализация ферментов и метаболических путей, компартментализация метаболических процессов в клетке. Методы изучения обмена веществ.
4. Окислительное декарбоксилирование пирувата: последова-тельнсть реакций, характеристика пируватдегидрогеназного мультиферментного комплекса.
5. Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК, цикл Кребса): внутриклеточная локализация и характеристика ферментов, последовательность реакций, регуляция и биологическая роль. Энергетический баланс ЦТК.
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
1. Укажите клеточную локализацию ферментов цикла Кребса.
А. Митохондрии. | С. Эндоплазматическая сеть. | Е. Лизосомы. |
В. Цитоплазма. | D. Ядро. |
2. Цикл трикарбоновых кислот - другое название цикла Кребса. Укажите трикарбоновую кислоту цикла Кребса.
А. α-Кетоглутарат. | С. Сукцинат. | Е. Малат. |
В. Изоцитрат. | D. Фумарат. |
3. Назовите продукт первой реакции цикла Кребса.
А. Цис-аконитат. | С. Цитрат. | Е. Малат. |
В. Изоцитрат. | D. α-Кетоглутарат. |
4. Назовите фермент цикла Кребса, активность которого лимитирует скорость протекания всего процесса в целом:
А. Цитратсинтаза. | D. Сукцинил-КоА-тиокиназа. |
В. Сукцинатдегидрогеназа. | Е. Малатдегидрогеназа. |
С. Изоцитратдегидрогеназа. |
5. Назовите фермент цикла Кребса, необходимый для синтеза ГТФ.
А. Цитратсинтаза. | D. Сукцинил-КоА-тиокиназа. |
В. Сукцинатдегидрогеназа. | Е. Малатдегидрогеназа. |
С. Изоцитратдегидрогеназа. |
6. Назовите метаболит цикла Кребса, который является макроэргическим соединением.
А. Цитрат. | С. Изоцитрат. | Е. Фумарат. |
В. Сукцинат. | D. Сукцинил-КоА. |
7. Укажите энергоэффект цикла Кребса (в молях АТФ), который обеспечивается процессом окислительного фосфорилирования в расчете на 1 моль ацетил-КоА.
А. 8 АТФ. | В. 11 АТФ. | С. 12 АТФ. | D. 9 АТФ. | Е. 3 АТФ. |
8. В реакции окислительного декарбоксилирования пирувата принимают участие все витамины, кроме:
А. В5. | В. В3. | С. В2. | D. В1. | Е. В7. |
9. При тканевом дыхании происходит универсализация энергии путем образования АТФ. Сколько молекул АТФ образуется при преобразовании α -кетоглутарата в сукцинил-КоА?
А. 5. | В. 6. | С. 3. | D. 2. | Е. 12. |
10. Общим промежуточным продуктом обмена белков, липидов и углеводов является:
А. Сукцинил-КоА. | С. Оксалоацетат. | Е. Цитрат. |
В. Ацетил-КоА. | D. Лактат. |
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА
Активность сукцинатдегидрогеназы мышц и
ее конкурентное ингибирование малоновой кислотой
Задание. Изучить активность сукцинатдегидрогеназы мышц и её конкурентное ингибирование малоновой кислотой.
Принцип. О действии сукцинатдегидрогеназы (СДГ), катализирую-щей окисление янтарной кислоты (НООС-СН2-СН2-СООН) до фумаровой (НООС-СН=СН-СООН), судят по обесцвечиванию введенного в реакционную смесь акцептора водорода 2,6-дихлорфенолиндофенола, который, восстанавливаясь, переходит в лейкоформу. Обесцвечивание реакционной смеси не происходит в присутствии малоновой кислоты (НООС-СН2-СООН), которая является конкурентным ингибитором СДГ.
Ход работы. Для получения ферментного препарата 1-2 г свежих мышц измельчают ножницами и растирают в ступке с небольшим количеством воды (2-3 мл) на протяжении 1 мин, потом мышечную кашицу переносят на двойной слой марли в воронке, промывают 25 мл дистиллированной воды. Промытую кашицу отжимают, переносят в пробирку и суспендируют стеклянной палочкой с 4 мл воды. Полученную суспензию равномерно разливают в четыре пробирки. Первую пробирку кипятят на протяжении 1-2 мин для инактивации фермента, затем в пробирки приливают реактивы по схеме, приведенной в таблице:
№ пробирки | Сукцинат, мл | Вода, мл | Малонат, мл | 2, 6-дихлорфенолиндофенол |
0,5 | - | 2 капли | ||
0,5 | - | 2 капли | ||
1,5 | - | 2 капли | ||
- | 0,5 | 2 капли |
Через 15 мин наблюдают исчезновение синего цвета во 2-й пробирке.
Практическое значение. В клинико-биохимических исследова-ниях используются методы определения окислительно-восстановитель-ных ферментов в биоптатах для оценки энергетического обмена при разных патологических состояниях, а также для токсикологии и фармакологии при изучении действия лекарственных препаратов и ядов, которые могут быть разобщителями или ингибиторами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 115-121, 137-142.
2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 175-181.
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль:Укрмедкнига, 2002.–С. 244-255, 312-319.
4. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 257-265.
5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 343-349.
6. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 281-296.
7. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 212-222.
ЗАНЯТИЕ 9