2015-03-20
243
Цель: Овладеть методикой определения количества Т- и В-лимфоцитов с помощью реакции Е- и ЕАС-розеткообразования
Промикроскопировать готовые мазки Т- и В-клеток, приготовленные с целью определения количества Т- и В-лимфоцитов в реакции розеткообразования (Е-РОК и ЕАС-РОК). Оформить протокол исследования в виде рисунка. Ответить на вопросы:
1. С какой целью проводят определение Т- и В-лимфоцитов?
2. Опишите принцип метода.
М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я
Техника постановки анализа
1. Для определения количества Т-клеток: концентрацию эритроцитов барана доводят раствором Хенкса (или средой 199) до 0,5%-ной концентрации; в силиконизированные или пластиковые пробирки объемом 1,2 мл внести 0,1 мл суспензии выделенных в градиенте лимфоцитов, доводят раствором Хенкса или средой 199 до объема 2 × 106 мл; смесь инкубируют при 37°С 5 мин, затем центрифугируют 5 мин при 750 об/мин и инкубируют 60 мин при +12°С; после инкубации клетки фиксируют глютаровым альдегидом (0,1 мл 0,8%-ного раствора). Мазки фиксируют в метаноле (или смеси Никифорова), красят по Романовскому-Гимзе.
|
|
|
2. Для определения количества В-клеток: содержание лимфоцитов, выделенных в градиенте фиколл-верографина, доводят раствором Хенкса или средой 199 до 2 × 106 мл; в силиконизированные или пластиковые пробирки вносят 0,1 мл лимфоцитов и 0,1 мл 0,5 %-ного раствора ЕАС комплекса (эритроциты барана, нагруженные AT в среде комплемента); смесь центрифугируют при 150 – 200 g/мин 5 мин. Образовавшиеся «розетки» фиксируют, добавляя в пробирки 0,05 мл 3%-ного раствора глютарового альдегида в фосфатном буфере. Фиксируют 20 мин при комнатной температуре и прекращают фиксацию добавлением избытка дистиллированной воды; затем клетки осаждают при центрифугировании (1000 об/мин). Надосадочную жидкость удаляют. Оставшуюся взвесь тщательно пипетируют и заносят на хорошо обезжиренное стекло, которое потом высушивают на воздухе и фиксируют 5 мин в метаноле. После окраски мазков по Романовскому-Гимзе препараты готовы для подсчета клеток. Время окрашивания – 17-20 мин в разведении 1:10.
