Рестриктазы класса III

Имеют некоторое сходство с рестриктазами класса I. Состоят из двух различных субъединиц, одна из которых обладает рестриктазной, а другая – метилазной активностью.

Кофакторы: АТФ и Mg²⁺

Расщепление ДНК не сопровождается гидролизом АТФ. цАМФ ускоряет реакцию.

Узнают несимметричные последовательности нуклеотидов длиной 5-6 нуклеотидных пар и расщепляют ДНК в стороне от участков узнавания на расстоянии 24-27 пар нуклеотидов. При этом образуются одноцепочечные 5'-концы длиной 2-3 нуклеотида.

При действии ферментов данного класса in vitro не удается исчерпывающе гидролизовать ДНК. Причины этого пока не ясны.

ДНК-МЕТИЛАЗЫ (ДНК-метилтрансферазы)

Обычно каждую рестриктазу сопровождают метилазы. Различают сайт-специфические метилазы, сопряженные с рестриктазами, и метилазы, используемые клетками про- и эукариот для различных регуляторных целей. Метилазы первого типа вместе с рестриктазами составляют т.н. RM-систему (систему рестрикции-модификации) и механизм их действия заключается в переносе метильной группы с S-аденозил-L-метионина на определенные остатки цитозина с образованием 5-метилцитозина, или аденина, с образованием N₆ –метиладенина (эукариотическая ДНК не метилируется в это положение) После метилирования, приводящего к модификации ДНК, многие рестриктазы (например EcoRI, в состав сайтов рестрикции которых входит данная метилированная последовательность), перестают расщеплять ДНК по этим сайтам.

RM-cистема представляет собой совокупность двух конкурирующих процессов, результатом которых является:

1. Защита собственной ДНК от расщепления

2. Защита клеток от инфицирования фагами

3. Ограничение скрещивания между различными видами бактерий

Большинство штаммов E. coli содержит два типа ферментов, метилирующих ДНК: Dam- и Dcm-метилазы, не связанные с RM-cистемой. Первая осуществляет перенос метильных групп в N-положение аденина в последовательности GATC. Dcm-метилаза, осуществляет метилирование остатков цитозина по положению С5 в последовательностях C^meCAGG и C^meCTGG. Для того чтобы избежать нежелательного влияния этих метилаз на клонируемые ДНК, в качестве хозяев используют мутантные штаммы E. coli: dam^- и dcm ^- (так обозначаются штаммы, лишенные этих метилаз). ДНК-метилазы бактериальных RM-систем применяют для блокирования in vitro соответствующих сайтов рестрикции на исследуемых фрагментах ДНК с целью получения ДНК больших размеров.

ДНК млекопитающих и высших растений часто содержит остатки 5-метилцитозина в CG-последовательностях. Такая ДНК не расщепляется теми из рестриктаз, которые содержат подобные последовательности в сайтах узнавания и чувствительны к такому характеру метилирования. Такие последовательности можно расщепить, используя изошизомеры с другим типом метилирования. В клетках эукариот есть участки ДНК, в которых частота CG намного выше, чем в других участках (т.н. островки CG). Они локализованы вокруг регионов, с которых считывается особо важная информация для клеточных функций. В этих регионах CG последовательности не метилируются. В противоположность этому, последовательности CG в неактивных генах метилированы, что ингибирует их экспрессию, т.е. считывание с них генетической информации.

Бактерия-хозяин может метилировать ДНК вируса и тем самым предотвратить его размножение.