ДНК-полимеразы

Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в ГИ находят ДНК-полимераза I E. coli и ее большой фрагмент (фрагмент Кленова), ДНК-полимераза фага Т4 и в последнее время термостабильные ДНК-полимеразы.

ДНК-полимераза I E. coli катализирует матричный синтез ДНК только в направлении 5'→3'.

ДНК-полимераза I E. coli - белок с мол. массой 109 килодальтон, обладающий тремя видами активности. В отличие от РНК-полимеразы, которая может синтезировать новую цепь, ДНК Pol I может расширять только существующую цепь. Поэтому, чтобы синтезировать молекулу ДНК, требуется наличие короткой РНК ( а не ДНК ) молекулы (5-12 нуклеотидов) со свободной 3'ОН – группой. Ее называют затравочной цепью или праймером. В живых клетках синтез праймера осуществляется ферментом праймазой, а в генной инженерии применяется, как правило, готовый продажный праймер.

1. Полимеразная активность в направлении 5ґ→ 3ґ. Синтез осуществляется на однонитевой матричной ДНК, в присутствии +дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP) путем присоединения нуклеотидных остатков к 3'ОН - концу комплементарной нити, являющейся в таком случае праймером. В этой реакции фермент катализирует образование фосфодиэфирной связи. За один цикл синтезируется лишь короткая цепь ДНК длиной в 10-50 нуклеотидов.

праймер

5ґ-AAGTT- 3ґ + Pol, (dNTP) →5ґ-AAGTT CCGATGG - 3ґ

3ґ-TTCAAGGCTACC- 5ґ 3ґ-TTCAAGGCTACC - 5ґ

матричная ДНК

2. Экзонуклеазная активность в направлении 5'→ 3' вызывает отщепление нуклеотидов c 5'-концов двунитевых ДНК и приводит к их деградации. Т.е происходит процесс обратный полимеризации. Эта активность может быть использована для удаления праймера.

3. Экзонуклеазная активность в направлении 3'→ 5' приводит к отщеплению нуклеотидов с 3 ' ОН – концов одно и двунитевых молекул ДНК. Это процесс протекает в 10 раз медленнее, чем полимеразная реакция. На двунитевой ДНК в присутствии нуклеозидтрифосфатов экзонуклеазная активность фермента подавляется полимеразной активностью. При помощи такой активности фермент может удалять неправильно вставленное основание, выполняя роль корректора, т.к. диэфирная связь расщепляется только в неспаренных участках ДНК.

Все три активности локализуются в разных участках фермента:

N-концевой домен - 5'→ 3' экзонуклеазная активность

С-концевой домен - 5'→ 3' полимеразная

Средний - 3'→ 5' экзонуклеазная

Чтобы устранить экзонуклеазную активность в направлении 5ґ→ 3ґ, которая может приводить к нежелательному расщеплению ДНК, с помощью фермента трипсина был отделен большой фрагмент, у которого отсутствует эта активность (фрагмент Кленова). В настоящее время фрагмент Кленова получают прямо из специально сконструированного штамма бактерий.

ДНК-полимераза I одновременно может вести реакцию полимеризации и гидролиз нуклеотидной цепи в направлении 5'→ 3', начиная с однонитевого разрыва (nick- ника- зарубки, разрыва) в двухнитевой ДНК. При этом НИК перемещается вдоль цепи ДНК в направлении 5'→ 3' на расстояние 1000 пар нуклеотидов. Процесс называется ник-трансляцией. Путем ник-трансляции ДНК-полимераза и ее фрагмент могут быть использованы для введения в синтезируемые цепи ДНК радиоактивно меченых дезоксирибонуклеотидов.

При этом одноцепочный разрыв перемещается вдоль двуцепочной ДНК, а 3'-ОН-конец используется в качестве затравки для ферментов. При этом ДНК-полимераза прокладывает себе путь с помощью 5'→ 3'- экзонуклеазы, а фрагмент Кленова вытесняет цепь ДНК с 5'-конца.

Фрагмент Кленова используют также для синтеза второй цепи ДНК, секвенирования ДНК по методу Сенгера, заполнения 5'-выступающих липких концов ДНК с образованием тупых концов, введения концевой радиоактивной метки, а также для удаления 3'-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК 3'→ 5'- экзонуклеазой этого фермента.

ДНК-полимераза фага Т4.

Эта полимераза обладает той же активностью, что и фрагмент Кленова, т.е. лишена 5'→ 3'- экзонуклеазной активности. В то же время 3'→ 5'- экзонуклеазная активность, особенно на однонитевой ДНК, у нее выше, чем у ФК в 200 раз. Это позволяет использовать Т4-ДНК-полимеразу для введения радиоактивной метки путем реакции обмена немеченного 3ґ- концевого нуклеотида на меченный радиоактивный изотоп.

Экзонуклеазная активность проявляется при отсутствии в среде нуклеотидов, полимеразную активность инициируют, добавляя в среду меченые радиоактивным изотопом нуклеотиды.

Задача: осуществить гидролиз сегмента ДНК с известной последовательностью до строго определенной точки, например, до инициаторного ATG-триплета структурного гена.

1. Синтезируем праймер, соответствующий началу этого гена.

2. Осуществляем денатурацию сегмента ДНК, содержащего изучаемый ген.

3. Вводим избыток синтетического праймера. При этом образуются комплексы между праймером и комплементарной цепью сегмента.

4. Обрабатываем ДНК фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I:

-одноцепочечный 3'-конец дуплекса удаляется (3'→5'- экзонуклеазная активность)

-цепь на 5'-конце достраивается с помощью 5'→ 3' полимеразной активности.