Приготовление биотеста

В ампулу с лиофилизированной культурой вносят 0,2 мл стерильной водопроводной воды и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

Одну-две капли культуры засевают в 2 пробирки с бульоном (МПБ, Хоттингера, бульон питательный сухой) с 0,5% глюкозы. Суточную бульонную культуру засевают в пробирки на скошенный агар (Хоттингера, мясопептонный, сухой питательный). Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы со скошенным картофельно-пептонным агаром. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды, инкубируют при 55°С в течение 10-12 суток в наклонном положении агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой. На 7, 10 и 12 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования. Достаточным количеством считают 80-90% спор в поле зрения. Культуру смывают стерильной дистиллированной водой. В целях освобождения от вегетативных клеток суспензию прогревают на водяной бане при температуре 65-70°С течение 30 мин, центрифугируют трехкратно с частотой вращения 33, 33с-1 (2000 об./мин) по 15 мин, промывая осадок стерильной дистиллированной водой после каждого центрифугирования. Отмытые споры суспендируют в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:1 по объему. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4°С в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками (срок хранения 2 года).

Чистоту культуры на всех этапах культивирования контролируют высевом на агаровые пластинки.

Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной суспензии десятикратно разводят до стерильной дистиллированной водой, высевая на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл ориентировочно из (предел разведения зависит от титра полученных спор). Посевы инкубируют в течение 48 часов, проводят подсчет выросших колоний. Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее арифметическое число колоний с учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

Например, при посеве на три чашки Петри с агаром суспензии в разведении 1:100000 , подсчитано 140, 110 и 134 колонии. Аналогичные высевы из разведении привели к образованию 12, 14 и 16 колоний; из - 5, 3 и 7 колоний. Вычисляем общее число колоний, а затем среднее количество колоний для каждого разведения 128, 14 и 5.

Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем титр жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведения, далее находим среднее арифметическое число колоний:

;

;

.

Таким образом, титр исходной суспензии составит:

спор в 1 мл.

Исходная суспензия должна содержать не менее спор в 1 мл. Споры в количестве вносят из исходной суспензии с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329-81) в 0,02 мл в носители (стерильные инсулиновые флакончики с ватно-марлевой пробкой или чашечки из алюминиевой фольги, разложенные в чашки Петри), подсушивают в термостате при 37°С или в эксикаторе над осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 часов.

Для определения фактической обсемененности исследуют не менее трех биотестов от каждой группы. Во флаконы (чашечки) вносят по 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги, отмывают в широкогорлых пробирках с бусами в 10 мл) и встряхивают в течение 10 мин на аппарате для встряхивания жидкостей с последующим высевом на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл суспензии из трех последовательных десятикратных разведении.

3. Определение устойчивости спор тест-культур к действию водяного насыщенного пара под избыточным давлением проводят при температуре °С.

Биотесты в упаковочной бумаге помещают в стерилизационной коробке в камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопаровой камере МПа ( ) проводят продувку парового стерилизатора (вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора) в течение 10 мин при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от 0,01 до 0,02 МПа (от 0,1 до 0,2 ). После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до МПа ( ), температура °С и через 5 мин (времени выживания спор тест-культуры) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем давления проводят максимум в течение 8 мин, спуск - в течение 3 мин.

Аналогичное исследование проводят в течение 15 мин времени выдержки (время гибели спор тест-культуры). Контроль температуры осуществляют максимальными термометрами. По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и проводят бактериологическое исследование.

Партию биотестов считают годными для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры соответствуют вышеописанным требованиям.

4. Для определения эффективности работы стерилизатора в обеззараженные биотесты и контрольный тест (без стерилизации) стерильно вносят по 5 мл питательной среды, инкубируют при 55°С в течение 7 суток при ежедневном просмотре посевов, делая высевы на агаровые пластинки из проросших емкостей.

При использовании полусинтетической среды с индикатором феноловым красным рост тест-культуры определяют по изменению красного цвета среды (рН ) на желто-оранжевый (рН ) за счет разложения глюкозы с образованием кислоты.

В целях исключения ложного отрицательного результата (при наличии роста тест-культуры отсутствует изменение цвета питательной среды) флаконы (пробирки) должны быть плотно закрыты стерильными резиновыми пробками (N 7,5; 12,5).

Отсутствие роста тест-культуры указывает на эффективность работы стерилизатора. Рост других культур микроорганизмов относят за счет вторичного обсеменения.

При наличии роста тест-штаммов проводится повторный контроль на удвоенном количестве биотестов. Если и при повторной проверке тест-культуры не инактивируются, осуществляют тщательный контроль технического состояния аппарата и контрольно-измерительных приборов. При отсутствии роста тест-культур в контрольном биотесте (не подвергшемся стерилизации) устанавливается причина (нежизнеспособность тест-культуры, несоблюдение методики приготовления биотестов, питательных сред, условий культивирования).

5. Для спорообразования используют:

- картофельно-пептонный агар (пептон - 5,0, мел - 1,0, агар - 25,0, картофельная вода - 1 000 мл), рН . Сырой картофель (200 г очищенного картофеля на 1 л водопроводной воды) тщательно моют, очищают от кожуры и глазков, нарезают мелкими ломтиками, заливают водопроводной водой и кипятят 30 мин после закипания (молодой картофель употреблять нельзя). Отвар отстаивают и фильтруют в холодном состоянии через ватно-марлевый фильтр. Доводят объем фильтрата до первоначального. Устанавливают рН . Добавляют пептон и агар. Нагревают, помешивая до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего добавляют мел. Разливают по флаконам, стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. После стерилизации среду во флаконах скашивают;

- пшеничный агар (пшеничная крупа - 500,0, агар - 25,0, дистиллированная вода - 1 000 мл), рН- .

Пшеничную крупу заливают дистиллированной водой. Через 12 часов настой аккуратно сливают, не выжимая, доводят до первоначального объема, добавляют агар и растапливают на водяной бане или в автоклаве (текучим паром 1 час). Остывший агар выкладывают на противень и срезают осадок. Агар растапливают на водяной бане, постоянно помешивая. Устанавливают рН . Разливают во флаконы. Стерилизуют текучим паром по 1 часу в течение 3 суток. После стерилизации среду скашивают.

6. Для контроля используют бульон Хоттингера рН , агар Хоттингера рН , питательный бульон сухой рН , питательный агар сухой рН , среду питательную для контроля стерильности рН , бульон из перевара кровяных сгустков, полусинтетическую среду с индикатором феноловым красным рН (аммоний фосфорно-кислый однозамещенный - - 1,0 г; магний серно-кислый - - 0,2 г, калий хлористый - KCl - 0,2 г, глюкоза - 5,0 г, феноловый красный - 0,02 г, бульон Хоттингера с содержанием аминного азота - 140-160 мг - 200 мл, дистиллированная вода - 800 мл, рН . Компоненты смешивают и растворяют при нагревании на водяной бане, доводят рН до , разливают во флаконы, стерилизуют при 110°С в течение 30 мин.

Химические тесты для контроля температурных параметров режимов работы воздушных стерилизаторов (1)

N п/п	Наименование химического соединения	Цвет, форма кристаллов, запах	Нормативно-техническая документация	Количество компонента, грамм	Температурный параметр, подлежащий контролю,°С
160-10°С 160+2°С	180-10°С 180+2°С
	Левомицет ин(2)	Белый или белый со слабым желтовато -зеленоватым оттенком кристаллический порошок без запаха	ГФ Х (3) ст.371	100,0	+(4)
	Кислота винная	Порошок белого цвета или прозрачные бесцветные кристаллы	ГОСТ 5817-77 ГОСТ 21205-83	100,0	-	+
	Гидрохино н	Бесцветные или светло-серые серебристые кристаллы	ГОСТ 19627-74	100,0	-	+
	Тиомочеви на	Блестящие бесцветные кристаллы	ГОСТ 6344-73	100,0	-	+
Примечание: 1 - В состав химических тестов, используемых для контроля работы воздушных стерилизаторов, краситель не добавляют, т. к. указанные химические соединения изменяют свой цвет при достижении температуры плавления; 2 - Относится к сильнодействующим лекарственным средствам, применение и хранение которых должно проводиться с предосторожностью, хранение в закрытых шкафах в сухом помещении; 3 - ГФ X - Государственная Фармакопея СССР, X издание; 4 - "+" - температурный параметр, для контроля используют химическое соединение.

Химические индикаторы в паровом стерилизаторе размещают в каждой обеззараживаемой ёмкости и два - в самой камере, в воздушных стерилизаторах - от 5 до 15 в зависимости от ёмкости камеры.

Приложение 8
к СП 1.3.3118-13

Порядок
замены фильтров очистки воздуха вытяжной и приточной систем вентиляции и определения их защитной эффективности

1. Замену фильтров очистки воздуха (ФОВ) приточных и вытяжных систем проводят в процессе планово-предупредительных ремонтов при достижении предельно допустимого перепада давлений, установленного проектом или службой главного инженера организации, исходя из требований не превышения (исключения возможности превышения):

Предельно допустимое сопротивление фильтрующих элементов, по условиям прочности фильтрующего материала для предотвращения его повреждения, не должно превышать:

- 1 500 Па (150 мм в. ст.) для фильтров из ткани ФПП (фильтрующее полотно Петрянова);

- 450 Па для НЕРА фильтров, 600 Па для ULPA фильтров (в соответствии с требованиями ГОСТ 51251-99 п.п. 5.3.2).

Замена фильтров очистки воздуха других типов осуществляется при увеличении исходного сопротивления фильтра при номинальной производительности в 2 раза.

Внеплановые замены фильтров очистки воздуха осуществляются в случаях превышения нормативного значения коэффициентов проницаемости.

Критическим сопротивлением для ФОВ является увеличение сопротивления в 2 раза по отношению к начальному при условии, что оно не более:

- предельно допустимого сопротивления ФОВ по условиям прочности фильтрующего материала для предотвращения его повреждения, которое принимается в соответствии с рекомендациями санитарных правил, но не более сопротивления, указанного в паспортных данных конкретного фильтра;

- предельно допустимого сопротивления ФОВ по условиям поддержания проектных параметров, указанного в проекте и/или паспорте вентиляционной установки;

- предельно допустимого сопротивления ФОВ, указанного в паспортных данных конкретного фильтра.

2. Перед демонтажем проводят предварительную дезинфекцию фильтра и магистрального воздуховода парами формалина либо аэрозольным способом (Приложение 1).

3. Распыление дезинфектанта осуществляется при работающей вентиляции. По окончании распыления вентиляция выключается и по истечении времени экспозиции фильтр может быть снят.

4. Работу по демонтажу фильтра проводят в костюме IV типа с использованием резиновых перчаток (под рабочими рукавицами) и респиратора.

5. Снятый фильтр помещают в крафт-мешок или другую упаковку и переносят для автоклавирования или сжигания в установленном порядке.

6. Работы по замене фильтра осуществляются техническим персоналом под наблюдением сотрудника подразделения, отвечающего за соблюдение требований биологической безопасности.

7. Инструментальный контроль защитной эффективности работы фильтров очистки воздуха, установленных в приточных и вытяжных фильтровентиляционных системах, должен производиться по двум параметрам: аэродинамическому сопротивлению и барьерной (защитной) эффективности. Последний тест, в случае ступенчатой фильтрации, проводится для каждой ступени отдельно.

Перед запуском в эксплуатацию фильтр должен быть проверен на проскок (по масляному туману, либо с использованием биологического аэрозоля или другим способом) и аэродинамическое сопротивление. В процессе эксплуатации фильтр периодически проверяется на проскок и аэродинамическое сопротивление.

8. Контроль эффективности фильтров очистки воздуха проводится регулярно в соответствии с графиком организации. Рекомендуемая периодичность проверки фильтров ФОВ:

- фильтров технологических систем и первых каскадов (при наличии двух и более каскадов) вытяжных систем - через каждые 6 месяцев непрерывной работы;

- фильтров на системах, обслуживающих помещения "заразной" зоны максимально изолированных лабораторий - через каждые 6 месяцев непрерывной работы;

- фильтров приточных систем и фильтров всех каскадов вытяжных систем - не реже одного раза в год;

- при циклической работе - не реже одного раза в год.

9. При проведении измерений соблюдают следующие условия:

- помещении, в котором проводятся измерения, необходимо поддерживать перепад давления, кратность воздухообмена и параметры микроклимата, соответствующие условиям эксплуатации данного помещения;

- система приточно-вытяжной вентиляции помещения должна функционировать в номинальном режиме;

- перед выполнением измерений должны быть временно удалены решётки для доступа к фильтрам очистки воздуха.

Для проведения испытаний по определению защитной эффективности (коэффициента проскока и аэродинамического сопротивления) в фильтровентиляционной системе монтируют штуцера для форсунки распылителя на расстоянии равном шестикратному диаметру воздуховода; а также штуцера на воздуховоде до испытуемого фильтра очистки воздуха (5) и после фильтра (6), расположенных на расстоянии равном трёхкратному диаметру воздуховода. При отсутствии прямолинейных участков необходимой длины допускается располагать мерное сечение в месте, делящем выбранный для измерения участок в отношении 3: 1 в направлении движения воздуха.

Направление штуцера по отношению к воздушному потоку определяется его назначением (с "заразной" стороны в направлении воздушного потока, с "чистой" стороны навстречу воздушному потоку). Срезы на трубках для отбора проб после проверяемой венткамеры также должны быть направлены навстречу потоку воздуха.

При наличии двух каскадов венткамер патрубками с завинчивающейся заглушкой должны оборудоваться оба каскада, причём средний патрубок будет служить как для ввода пробоотборной трубки (всегда в первую очередь), так и для ввода трубки с аэрозолем (когда проверяется вторая ступень).

Для герметизации воздуховода, после проверки эффективности венткамер, пробоотборные патрубки с завинчивающейся заглушкой оборудуются резиновыми прокладками, а также приспособлениями для опломбирования.

10. Для создания аэрозоля в качестве модели используют культуры В. prodigiosum (апатогенные штаммы S. marcescens, Chromobacterum prodigiosum, колонии которых на свету образуют пигмент от красного до розового цветов) или Е. coli, а также специальные устройства-распылители, обеспечивающие заданные характеристики аэрозоля. В целях минимального рассеивания бактериального аэрозоля в окружающую среду и направления факела аэрозоля в отверстие воздуховода перед фильтром применяют специальную насадку. Для определения счётной концентрации и фракционно-дисперсного состава биологического аэрозоля используют импактор микробиологический БП-50, микроциклоны или другие приборы аналогичного типа.

Для оценки защитной эффективности ФОВ проводится следующее:

10.1. Отбор проб аэрозоля осуществляют двумя импакторами одновременно до прохождения фильтра (контроль) и после прохождения его (опыт). По результатам роста тест-штамма на агаровых пластинках или чашках Петри до и после прохождения фильтра судят о его защитной эффективности. Используют односуточную культуру тест-штамма в концентрации м. к. в мл. Для проведения опыта приборы монтируют в следующей последовательности: насадку устанавливают на отверстии воздуховода перед фильтром с помощью болтов, шланги компрессора надевают на конец форсунки распылителя. К входному и выходному отверстиям воздуховода после фильтра присоединяют через шланги два микробиологических импактора БП-50, подключают к сети компрессор и оба аспиратора. Перед началом опыта проверяют работу компрессора и скорость движения воздуха через импактор. Опыт проводят при работающей вентиляции.

10.2. В колбу распылителя заливают приготовленную взвесь тест-штамма, после чего вставляют форсунку. Устанавливают распылитель на уровне отверстия воздуховода, включают компрессор и оба импактора. Соблюдаются следующие условия: скорость распыления по жидкости мл/мин, скорость распыления по воздуху V=50 л/мин, время распыления - 10 мин, средний диаметр аэрозольных частиц мкм (lg d=0,389), максимальный диаметр частиц мкм при логарифмически нормальном распределении (среднее квадратичное отклонение lg d = 0,229); скорость отбора проб аэрозоля импактором БП-50 V=50 л/мин, продолжительность отбора проб аэрозоля - 10 мин, объем отбираемой пробы до фильтра 20-50 л, после фильтра 200-500 л. По истечении срока отключают сначала компрессор, а затем импакторы. Чашки Петри вынимают из импакторов и инкубируют при 37°С в течение 2 суток. После проведения опыта установку дезинфицируют.

10.3. Учёт результатов проводят через 24 и 48 часов. В популяции В. prodigiosum наряду с типично окрашенными колониями могут появляться различные по цвету варианты: розовые, слабо розовые, с розовым центром. Об эффективности задержания исследуемым фильтром аэрозольных частиц судят по отношению числа аэрозольных частиц, осевших до фильтра и после него. Эффективность фильтра выражают в процентах. При исправных фильтрах не должно быть роста колоний тест-культуры на чашках после фильтра, в то время как до фильтра (для обеспечения достоверности испытаний) их должно быть не менее 200 колоний на чашках (положительный контроль). Коэффициент проскока фильтров очистки воздуха не должен превышать по отношению к исходной концентрации тест-штамма.

11. Допускается использование других методик и процедур проведения проверки ФОВ (тестирование с использованием аэрозолей турбинных масел, диоктилфталата - DOP, диэтилгексилсебацината - DEHS, тестирование с использованием латексных микрочастиц) при условии соблюдения основных технических параметров опыта.

12. Инструментальный контроль защитной эффективности фильтров с тестированием аэрозолем стандартного масляного тумана с размером частиц 0,1 - 0,3 мкм и концентрацией частиц проводится с помощью фотометра (нефелометра) или измерителя массовой (счётной) концентрации аэрозольных частиц. Сущность нефелометрического метода определения коэффициента проницаемости заключается в определении отношения концентрации стандартного масляного тумана, прошедшего через фильтровентиляционную систему, к концентрации стандартного масляного тумана, подаваемого на вход фильтровентиляционной системы, которым соответственно пропорциональны величины световых потоков, измеряемых фотометром.

Коэффициент проскока фильтров очистки воздуха из ткани ФПП (фильтрволокно Петрянова) не должен превышать % по отношению к исходной концентрации аэрозоля стандартного масляного тумана. В случае если среднее значение коэффициента проскока превышает допустимое, следует заменить фильтр или устранить в данной точке дефект фильтра и/или его установки.

Для фильтров НЕРА и ULPA значения коэффициента проскока регламентированы ГОСТ в зависимости от их класса.

Локальное значение проскока аэрозоля не должно превышать значение, соответствующее классу ФОВ (согласно классификации НЕРА и ULPA фильтров по ГОСТ Р ЕН 1822-1-2010) в любой точке фильтра.

Фильтрующие элементы очистки воздуха считаются выдержавшим испытание, если коэффициенты проницаемости (проскока) не превышают указанных значений.

Инструментальный контроль аэродинамического сопротивления - перепада давления между входом и выходом из корпуса (камеры), т.е. перепад давления "до" и "после" фильтра, должен производиться любым аттестованным измерителем перепада давлений или манометром дифференциальным цифровым. Сопротивление ФОВ складывается из сопротивления корпуса камеры и сопротивления самого фильтрующего (фильтрующих) элемента (ов).

13. Результаты определения защитной эффективности фильтров очистки воздуха оформляют протоколом, форма приведена ниже.

14. Проверку защитной эффективности ФОВ могут осуществлять юридические лица, организации, индивидуальные предприниматели, независимо от организационно-правовых форм и форм собственности, имеющие соответствующие аттестаты аккредитации или область деятельности в соответствии с Уставом.