Качественный анализ аминокислотных смесей методом тонкослойной хроматографии

Лабораторная работа «Анализ белков и аминокислот»

Цели и задачи: изучить методы выделения и анализа веществ из биологических объектов, строение и свойства аминокислот и белков, освоить хроматографический метод исследования, объяснить возможности использования этого метода в медицинской практике.

Белки - это высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки составляют основу и структуры, и функций живых организмов.

При гидролизе белков образуются аминокислоты. Все многообразие белков определяется количественным и качественным содержанием различных аминокислот, взаиморасположением аминокислотных остатков в белковой молекуле.

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны, а также биомембраны растительных и животных тканей.

Денатурация белков-нарушение структуры нативной молекулы белка, приводящее к потере характерных для белка свойств (растворимость, биологическая активность и т.д.). Денатурация может происходить под влиянием как физических, так и химических факторов. Внешне она проявляется как потеря растворимости, особенно в изоэлектрической точке.

Качественный анализ аминокислотных смесей методом тонкослойной хроматографии.

Реактивы и оборудование: растворы аминокислот 0,04 М, смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7), раствор нингидрина в ацетоне 0,5%, пластины хроматографические,капиллярные пипетки, сосуд хроматографический с крышкой, палочки стеклянные, термостолик, спрей-камера, пульверизатор.

Проводят карандашом линию на расстоянии 2 см от нижнего края хроматографической пластины. На линии на равном расстоянии размечают 4 точки. В пипетку набирают раствор первой аминокислоты. Прикасаясь кончиком пипетки к пластине в точке 1, выпускают раствор. То же проделывают для точек 2, 3, 4 с растворами оставшихся аминокислот и их смесью, каждый раз используя чистую пипетку.

Хроматограмму помещают в хроматографический сосуд, на дно которого налита смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7) так, чтобы край пластины был погружен в проявитель на 1 см. Сосуд плотно закрывают крышкой и оставляют в нем хроматограмму на время, за которое проявитель пройдет по ней путь снизу вверх, равный примерно 10 см. Хроматограмму вынимают из сосуда, отмечают границу фронта проявителя и высушивают на термостолике. На высушенную хроматограмму наносят в спрей-камере при помощи пульверизатора 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне до равномерного (без подтеков) смачивания. Затем хроматограмму помещают на термостолик при температуре 70 °С на 15 мин. Позиции аминокислот на хроматограмме выявляются в виде сине-фиолетовых пятен.

Идентификацию аминокислот можно осуществить по значению R_f (коэффициент распределения). Для этого измеряют расстояние, пройденное проявителем от линии старта до границы фронта проявителя, а так же расстояние от точки нанесения каждой аминокислоты до центра цветного пятна, образовавшегося в результате нингидриновой реакции. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента распределения (R_f) каждой аминокислоты-свидетеля. Такие же расчеты проводят с аминокислотами исследуемой смеси. Сопоставляя величины R_f аминокислот-свидетелей и аминокислот исследуемой смеси, делают заключение о природе аминокислот в составе изучаемой смеси. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне, идентичны.

1. Зарисуйте хроматограмму.

2. Рассчитайте значения Rf для всех веществ. Сопоставьте значения. Сделайте вывод.

2. Цветные реакции на белки.

Реактивы и оборудование: раствор белка, реактив Миллона, 10% раствор сахарозы, конц. серная кислота, уксусная кислота ледяная, 0,2% раствор нингидрина в спирте, пробирки, спиртовки, пипетки.