Антителообразование

Природа антител. В ответ на введение антигена иммунная система вырабатывает антитела – белки, способные специфически соединяться с антигеном, вызвавшим их образование, и таким образом участвовать в иммунологических реакциях. Относятся антитела к γ-глобулинам, т. е. наименее подвижной в электрическом поле фракции белков сыворотки крови. В организме γ-гло-булины вырабатываются особыми клетками – плазмоцитами. Количество γ-глобулина в сыворотке крови составляет примерно 30% от всех белков крови (альбуминов, а-, b-глобулинов и др.). В соответствии с Международной классификацией γ-глобулины, несущие функции антител, получили название иммуноглобулинов и обозначаются символом Ig. Следовательно, антитела – это иммуноглобулины, вырабатываемые в ответ на введение антигена и способные специфически взаимодействовать с этим же антигеном.

Функции антител. Первичная функция антител состоит во взаимодействии их активных центров с комплементарными им детерминантами антигенов. Вторичная функция антител состоит в их способности:

§ связывать антиген с целью его нейтрализации и элиминации из организма, т. е. принимать участие в формировании защиты от антигена;

§ участвовать в распознавании «чужого» антигена;

§ обеспечивать кооперацию иммунокомпетентных клеток (макрофагов, Т- и В-лимфоцитов);

§ участвовать в различных формах иммунного ответа (фагоцитоз, киллерная функция, ГНТ, ГЗТ, иммунологическая толерантность, иммунологическая память).

Применение антител в медицине. Вследствие высокой специфичности и большой роли в защитных иммунных реакциях антитела используют для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний, определения иммунного статуса организма, профилактики и терапии ряда инфекционных и неинфекционных болезней. Для этого существуют соответствующие иммунобиологические препараты, созданные на основе антител и имеющие целевое назначение (см. главу 10).

Структура антител. Белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам, так как состоят из протеина и Сахаров; построены из 18 аминокислот. Имеют видовые отличия, связанные главным образом с набором аминокислот. Молекулярная масса иммуноглобулинов находится в пределах 150.900 кД. Их молекулы имеют цилиндрическую форму, они видны в электронном микроскопе. До 80% иммуноглобулинов имеют константу седиментации 7S; устойчивы к слабым кислотам, щелочам, нагреванию до 60ºС. Выделить иммуноглобулины из сыворотки крови можно физическими и химическими методами (электрофорез, изоэлектрическое осаждение спиртом и кислотами, высаливание, аффинная хроматография и др.). Эти методы используют в производстве при приготовлении иммунобиологических препаратов. Иммуноглобулины по структуре, антигенным и иммунобиологическим свойствам разделяются на пять классов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Иммуноглобулины М, G, А имеют подклассы. Например, IgG имеет четыре подкласса (IgG,, IgG2, IgGj, IgG4). Все классы и подклассы различаются по аминокислотной последовательности. Иммуноглобулины человека и животных сходны по строению.

Р. Портер и Д. Эдельман установили строение молекулы иммуноглобулинов. По их данным, молекулы иммуноглобулинов всех пяти классов состоят из полипептидных цепей: двух одинаковых тяжелых цепей Н (от англ, heavy – тяжелый) и двух одинаковых легких цепей – L (от англ, light – легкий), соединенных между собой дисульфидными мостиками. Соответственно каждому классу иммуноглобулинов, т.е. М, G, А, Е, D, различают пять типов тяжелых цепей: ц (мю), у (гамма), а (альфа), е (эпсилон) и 5 (дельта), имеющих молекулярную массу в пределах 50.70 кД (содержат 420-700 аминокислотных остатков) и различающихся по антигенносте. Легкие цепи всех пяти классов являются общими и бывают двух типов: к (каппа) и х (ламбда); имеют молекулярную массу 23 кД (214.219 аминокислотных остатков). L-цепи иммуноглобулинов различных классов могут вступать в соединение (рекомбинироваться) как с гомологичными, так и с гетерологичными Н-цепями. Однако в одной и той же молекуле могут быть только идентичные L-цепи (к или А.). Как в Н-, так и в L-цепях имеется вариабельная – V (от англ-various – разный) область, в которой последовательность аминокислот непостоянна, и константная – С (от англ, constant – постоянный) область с постоянным набором аминокислот. В легких и тяжелых цепях различают NH2- и СООН-концевые группы.При обработке γ-глобулина меркаптоэтанолом разрушаются дисульфидные связи и молекула иммуноглобулина распадается на отдельные цепи полипептидов. При воздействии протеолитическим ферментом папаином иммуноглобулин расщепляется на три фрагмента: два некристаллизующихся, содержащих детерми-нантные группы к антигену и названных Fab-фрагментами І и II (от англ, fragment antigen binding – фрагменты, связывающие антиген) и один кристаллизующий Fc-фрагмент (от англ, fragment crystal!izable). FabI- и FabII-фрагменты сходны по свойствам и аминокислотному составу и отличаются от Fc-фрагмента; Fab-и Fc-фрагменты являются компактными образованиями, соединенными между собой гибкими участками Н-цепи, благодаря чему молекулы иммуноглобулина имеют гибкую структуру. Как Н-цепи, так и L-цепи имеют отдельные, линейно связанные компактные участки, названные доменами; в Н-цепи их по 4, а в L-цепи – по 2. Активные центры, или детерминанты, которые формируются в V-областях, занимают примерно 2% поверхности молекулы иммуноглобулина. В каждой молекуле имеются две детерминанты, относящиеся к гипервариабельным участкам Н-и L-цепей, т. е. каждая молекула иммуноглобулина может связать две молекулы антигена. Поэтому антитела являются двухвалентными.

Типовой структурой молекулы иммуноглобулина является IgG. Остальные классы иммуноглобулинов отличаются от IgG дополнительными элементами организации их молекул. Так, IgM представляет собой пентамер, т.е. пять молекул IgG, соединенных полипептидной цепью, обозначаемой буквой J (от англ, joining chain – строение молекулы). IgA бывает обычным, т. е. мономерным, а также ди- и тримерным. Различают IgA сывороточный и секреторный. В последнем молекула соединена с секреторным компонентом (SC), выделяемым эпителиальными клетками, что защищает IgA от разрушения ферментами. IgE обладает высокой цитофильностью, т.е. способностью присоединяться к тучным клеткам и базофилам, в результате чего клетки выделяют гистамин и гистаминоподобные вещества, вызывающие ГНТ. IgD склонен к агрегации, имеет дополнительные дисульфидные связи.

В ответ на введение любого антигена могут вырабатываться антитела всех пяти классов. Обычно вначале вырабатывается IgM, затем IgG, остальные – несколько позже. Основную массу сывороточных иммуноглобулинов (70.80 %) составляет IgG; на долю IgA приходится 10-15 %, IgM – 5.10 %, IgE – 0,002 % и IgD – около 0,2 %. Содержание иммуноглобулинов меняется с возрастом. При некоторых патологических расстройствах наблюдаются отклонения в уровне их содержания в крови. Например, концентрация IgG возрастает при инфекционных болезнях, аутоиммунных расстройствах, снижается при некоторых опухолях, агаммаглобулинемии. Содержание IgM увеличивается при многих инфекционных болезнях, снижается при некоторых имму-нодефицитных состояниях.

Синтез антител. Как уже было сказано, иммуноглобулины синтезируются плазмоцитами, которые образуются в результате дифференцировки полипотентной стволовой клетки. Плазмоцит синтезирует как неиммунный, так и иммунный γ-глобулин. Информацию о специфичности синтезируемого иммуноглобулина плаз-моциты получают от В-лимфоцитов; L- и Н-цепи синтезируются на полирибосомах плазмоцита отдельно и соединяются в единую молекулу перед выделением из клетки. Сборка молекулы иммуноглобулина из Н- и L-цепей происходит очень быстро, в течение 1 мин. Выделение иммуноглобулина из плазмоцита осуществляется путем экзоцитоза или клазматоза, т. е. отпочковывания части цитоплазмы с иммуноглобулином. Каждый плазмоцит синтезирует до 2000 молекул в секунду. Синтезированные антитела поступают в лимфу, кровь, тканевую жидкость.

Генетика антител. Иммуноглобулин, как и всякий белок, обладает антигенностью. В молекуле иммуноглобулина различают три типа антигенных детерминант: изотипические, аллотипические и идиотипические. Изотипические детерминанты (изотипы) являются видовыми, т. е. они идентичны для всех особей данного вида (например, человека, кролика, собаки). Аллотипические детерминанты (аллотипы) у одних особей данного вида имеются, у других – отсутствуют, т. е. они являются индивидуальными. Наконец, идиотипические детерминанты (идиоти-пы) присущи только молекулам антител, обладающих определенной специфичностью. Эти детерминантные различия обусловлены числом и порядком чередования аминокислот в активном центре молекулы иммуноглобулина.

Изотипические детерминанты располагаются в С-части Н- и L-цепей и служат для дифференцировки иммуноглобулинов на классы и подклассы. Аллотипические детерминанты отражают внутривидовые антигенные различия иммуноглобулинов, а идиотипические детерминанты – индивидуальные различия в строении активного центра. Следовательно, имеется огромное разнообразие иммуноглобулинов, различающихся по типу антигенных детерминант. В зависимости от изотипов существует 5 классов и множество подклассов; от аллотипов – только у Н-цепей известно до 20 разновидностей; с учетом идиотипов, т. е. строения активного центра, антитела различаются не только в классах и подклассах, но даже в аллотипах. Этим определяются множественность антител и их специфичность по отношению ко всему многообразию антигенов, существующих в природе. Число вариаций активных центров антител огромно, практически беспредельно, так как оно определяется числом Н- и L-цепей, их вариантами (аллотипами) и особенно идиотипическим разнообразием активных центров. Такое различие закреплено генетически и осуществляется в процессе формирования активных центров в зависимости от специфичности активного центра антигена. Иммуноглобулиновая молекула кодируется тремя группами генов. Одна группа кодирует Н-цепь любого класса, другая – L-цепь к-типа и третья – L-цепь Я-типа. Благодаря постоянным мутациям генов, мутациям клонов им-мунокомпетентных клеток, главным образом лимфоцитов, практически на введение любого антигена могут последовать реакция образования специфического антитела и размножение того клона лимфоцитов, который синтезирует антитела, комплементарные антигену. Следует подчеркнуть, что одна плазматическая клетка вырабатывает антитела только одной специфичности. Следовательно, в организме должно существовать множество клонов иммунокомпетентных клеток. Окончательно механизм синтеза и передачи по наследству способности выработки огромного количества специфических антител буквально к любому из многочисленных антигенов неясен. Наиболее полно этот механизм объясняют клонально-селекционная теория Ф. Бернета и теория С. Тонегавы.

Динамика антителообразования. Способность к образованию антител появляется во внутриутробном периоде у 20-недельного эмбриона; после рождения начинается собственная продукция иммуноглобулинов, которая увеличивается до наступления зрелого возраста и несколько снижается к старости. Динамика образования антител имеет различный характер в зависимости от силы антигенного воздействия (дозы антигена), частоты воздействия антигена, состояния организма и его иммунной системы. При первичном и повторном введении антигена динамика антителообразования также различна и протекает в несколько стадий. Выделяют латентную, логарифмическую, стационарную фазу и фазу снижения. В латентной фазе происходят переработка и представление антигена иммунокомпетентным клеткам, размножение клона клеток, специализированного на выработку антител к данному антигену, начинается синтез антител. В этот период антитела в крови не обнаруживаются. Во время логарифмической фазы синтезированные антитела высвобождаются из плазмоцитов и поступают в лимфу и кровь. В стационарной фазе количество антител достигает максимума и стабилизируется, затем наступает фаза снижения уровня антител. При первичном введении антигена (первичный иммунный ответ) латентная фаза составляет 3-5 сут, логарифмическая – 7-15 сут, стационарная – 15-30 сут и фаза снижения – 1-6 мес и более. Особенностью первичного иммунного ответа является то, что первоначально синтезируется IgM, а затем IgG.

В отличие от первичного иммунного ответа при вторичном введении антигена (вторичный иммунный ответ) латентный период укорочен до нескольких часов или 1-2 сут, логарифмическая фаза характеризуется быстрым нарастанием и значительно более высоким уровнем антител, который в последующих фазах длительно удерживается и медленно, иногда в течение нескольких лет, снижается. При вторичном иммунном ответе в отличие от первичного синтезируются главным образом IgG.

Такое различие динамики антителообразования при первичном и вторичном иммунном ответе объясняется тем, что после первичного введения антигена в иммунной системе формируется клон лимфоцитов, несущих иммунологическую память о данном антигене. После повторной встречи с этим же антигеном клон лимфоцитов с иммунологической памятью быстро размножается и интенсивно включает процесс антителогенеза.

Очень быстрое и энергичное антителообразование при повторной встрече с антигеном используется в практических целях при необходимости получения высоких титров антител при производстве диагностических и лечебных сывороток от иммунизированных животных, а также для экстренного создания иммунитета при вакцинации.

Виды антител. Помимо полноценных антител, обладающих специфичностью и активным участием в реакциях иммунной защиты, выделяют нормальные, или естественные, антитела и неполные антитела. К нормальным относят антитела, обнаруживаемые у людей или животных, не подвергавшихся какой-либо иммунизации. Их роль в защите не совсем ясна. К неполным антителам относятся иммуноглобулины с одним активным центром (валентностью). Эти антитела неполноценны, так как, соединяясь с антигеном, они не могут агрегировать частицы в конгломераты. У неполных антител второй центр имеется, однако он экранирован или имеет малую авидность. Для выявления неполных антител используют реакцию Кумбса. После иммунизации, даже монодетерминантным антигеном, в пуле иммуноглобулинов, синтезируемых совокупностью клеток, содержатся антитела, различающиеся между собой, т. е. сыворотки содержат поликлональные антитела. Эта гетерогенность антител обусловлена тем, что каждый плазмоцит вырабатывает только один тип, вид, класс, подкласс антител. Следовательно, каждая клетка или ее потомство, клон вырабатывают свой тип антител, получивших название моноклопальных. Принципиально моноклональные антитела можно получить искусственно, культивируя каждую антителопродуцирующую клетку, т. е. получая моноклональную культуру клеток. Однако практически это трудно осуществимо. Поэтому гибридную клетку получают путем слияния иммунного антителопродуцирующего В-лимфоцита, т. е. лимфоцита, взятого от иммунного животного и раковой миеломной клетки. Такая гибридома приобретает свойства родительских клеток, т. е. хорошо размножается на искусственных питательных средах (как и миеломная клетка) и вырабатывает антитела, специфичные для данного В-лимфоцита. Впервые гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, получили Д. Келлер и Ц. Мильштейн (1975). Моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных препаратов, а также при проведении различных исследований. Способы промышленного получения моноклональных антител описаны в главе 6.

В последние годы открыт еще один вид антител – абзимы. Это антитела-катализаторы, способные в несколько тысяч раз ускорять биохимические реакции, воздействуя на промежуточные вещества реакции. Механизм их действия изучается.