Микроскопические исследования

Микроскопия - обязательный метод всякого бактериального исследования.

С помощью световой микроскопии выявляют микробов в первичных материалах, в посевах и органах зараженных лабораторных животных, определяют форму и величину бактериальных клеток, свойственное им расположение (соединение), подвижность, способность воспринимать окраску, образовывать капсулы, споры, жгутики, формировать включения и зернистость. Иногда эти признаки весьма характерны и имеют важное значение при идентификации бактерий. В других случаях можно лишь констатировать. что наблюдаемые морфологические и тинк­ториа.1ьные свойства микроба соответствуют виду, определенному с помощью других методов. Но такое подтверждение тоже необходимо.

Значительно большее значение при идентификации патогенных микробов имеет люминесцентно-серологический метод, позволяющий наблюдать одновре­менно форму микроба и его реакцию с антителами.

Исследование живых микробов. Его проводят главным образом для опре­деления подвижности бактерий. Препараты лучше готовить из молодых культур через 3-6 ч после высева в жидкую питательную среду: в эти сроки подвиж­ность, свойственная тем или иным видам микробов, наиболее выражена. Если среда мутная, то пробу берут из верхнего слоя культуральной жидкости; прозрачную среду при наличии осадка предварительно встряхивают.

Метод – «раздавленная капля». Небольшую каплю культуры помещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом так, чтобы не образова­лись пузырьки воздуха; излишек жидкости, выступившей из-под стекла, убирают фильтровальной бумагой. Препарат исследуют под микроскопом сразу же после приготовления. Во избежание быстрого высыхания препарата нижние края покровного стекла перед накрыванием капли тонко смазывают вазелином.

Метод – «висячая капля». Берут предметное стекло с лункой и смазывают ее края тонким слоем вазелина. На чистое профламбированное и остывшее по­кровное стекло, в центр, помещают маленькую каплю культуральной жидкости. Предметным стеклом лункой книзу накрывают каплю так, чтобы она оказалась под центром лунки. При небольшом нажиме стекла склеиваются, после чего препарат переворачивают покрывным стеклом вверх. Висячая капля не должна касаться дна и краев лунки.

Исследование окрашенных микробов. Микроскопия окрашенных микробов - основной способ изучения их формы и строения. Окрашенные бактерии хорошо заметны в поле зрения. Многочисленные способы окраски позволяют наблюдать все детали клетки: капсулу, жгутики, эндогенные образования и включения.

Процесс окрашивания препаратов обычно включает следующее этапы: выбор кpaсок и приготовление их рабочих растворов; приготовление мазков, их высушивание и фиксирование; окраску препаратов по избранному способу и их промывание.

Приготовление красок. Красители для микробов имеют, кислую щелочную или нейтральную реакцию. Многие виды бактерий хорошо красятся основными красками, но вообще способность микробов воспринимать кислые или основные краски зависит от возраста культуры и реакции среды (мазка). Учитывая это, В растворы красителей вводят щелочи или кислоты.

Обычно применяют водные и спирто-водные растворы красок.

Водные рабочие растворы готовят в таких концентрациях: 0,15% фуксина кислого, 0,5 % эозина, 2% сафранина, 1-2% малахитовой зелени l-l,5% нейтральрота. Водные растворы большинства красителей нестойкие, и их применя­ют свежоприготовлеными.

Спитрто-водные растворы. Некоторые красители можно долго хранить в спир­товых растворах. В 100 мл 96%-ного этилового спирта в темной склянке с притepтой пробкой растворяют одну из красок основного фуксина 8,1 г, метиленовой сини 7 г, генцианвиолета 4,8 г. Для Лучшего растворения смеси выдерживают в термостате при 37⁰С и периодически встряхивают. Из этих растворов уже через сутки можно готовить рабочие разведения: на 1 объем краски берут 4-9 объемов дистиллированной воды. пользоваться такими рабочими растворами можно не более 1-2 дней.

Специальные растворы красителей с добавлением карболовой кислоты или едкого калия обладают большими красящими способностями и стойкостью, дольше хранятся.

Карболовый фуксин Циля. 1г основного фуксина растирают в ступке спер­ва с 2-3 каплями глицерина, а затем тщательно перемешивают при постепенном добавлении 10 мл этилового спирта, 5 г карболовой кислоты и, наконец, 100 мл дистиллированной воды. Раствор сливают в склянку с плотной пробкой, помещают на сутки в термостат и фильтруют через бумажный фильтр (бумагу).

Для окраски кислотоустойчивых микробов, а также спор употребляют краску описанной рецептуры. Для окрашивания возбудителей вибриоза краску разводят 1:5 дистиллированной водой, а в других случаях – 1:10 (фуксин Пфейфера) непосредственно перед употреблением.

Карболовый генцианвиолет готовят, как фуксин Циля, с той лишь разницей, что карболовой кислоты берут не 5 г, а 2 г. Для работы используют 10%-ный водный раствор краски.

Метиленова синь по Лёффлеру. К30 мл насыщенного спиртового, профильтрованного через бумагу раствора краски добавляют 100 мл дистиллированной воды и 1мл 1%-ного водного раствора едкого калия. Склянку плотно закрывают и выдерживают 1 месяц в термостате, после чего красящая способность синьки повышается, и появляются свойствоокрашивать различные субстраты в разные цвет (метохромазия).

Краска Романановского – Гимзы: имеют в своем составе краски азур и эозин.

Выпускаются в продажу в виде готового основного раствора. Окрашивает раз­ные компоненты клеток (и бактерий) в зависимости от их реакции в синий или розовый цвет. Применяется для окрашивания ядерных элементов, волютиновых гранул и капсул. Непосредственно перед употреблением ее разводят 1:10-15 дистиллированной водой, лучше слабощелочной реакции (рН 7,2). Нa одно стек­ло с препаратами нужно 4-5мл разведенной краски.

При наличии сухой краски Романовского - Гимзы основной раствор ее готовят так: 3,8 г краски растворяют в 250 мл метилового спирта, добавляют 250 мл глицерина и перемешивают.

При отсутствии продажной краски Романовского - Гимзы аналогичную краску составляют на месте. Готовят отдельно 0,1 %-ные растворы азура II и эозина в свежепрокипяченной дистиллированной воде. Оба раствора в плотно закрытых флаконах темного стекла можно хранить длительно. Непосредственно перед употреблением растворы разводят (и смешивают) из расчета: по две капли каждой краски на 1 мл дистиллированной воды.

Краска по Ребигеру: 5-20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40%-ного формалина, отстаивают до следующего утра и фильтруют через бумагу. Хранят во флаконе темного стекла под резиновой пробкой.

Фуксин-синька по Муромцеву. Готовят растворы: а) 0,15 г основного фук­сина и 10 г кристаллической карболовой кислоты в 20 МЛ 96⁰-ного этилового спирта; б) 2,5 г метиленовой сини в 200 мл дистиллированной воды. Обе краски помешивают и фильтруют через два слоя бумаги. Хранят под притертой или ре­зиновой пробкой.

Раствор Люгоголя. 2 г йодида калия растворяют в 10мл воды; добавляют 1 г кристаллического йода 11 выдерживают несколько часов в термостате до пол­ного растворения йода; доливают дистиллированной воды до 300 мл и фильтру­ют через бумагу. Хранят во флаконах из темного стекла.

Красящие бумажки по Синеву. Ввиду быстрой порчи рабочих растворов красок взамен их широко пользуются красящими бумажками. Их приобретают в централизованном порядке или готовят на месте.

Пригодная для этой цели фильтровальная бумага должна отвечать следующим требованиям:

быть абсолютно чистой и на просвет однородной;

окрашиваются растворами красок равномерно, без пятен;

для проверки полоску бумаги проводят через краску, налитую в чашку Петри, высушивают на воздухе и осматривают в падающем свете;

быстро омачиваться дистиллированной водой и отдавать краску; красящую бумажку кладут на предметное стекло и наливают несколько капель дистиллированной воды;

вода должна быстро впитаться в бумагу и у ее краев интен­сивно окраситься.

Краску (приготовление см. ниже) наливают в тазик или в тарелку. Бумагу режут на ровные полоски 2Х50 см. Полоску держат пинцетом и погружают ее попеременно обеими сторонами в краску. Через 8-10 с полоску вынимают дают краске стечь и прикрепляют прищепками к веревке для высушивания при комнатной температуре. Сухие полоски режут на кусочки длиной 4,5 см или квадратные (2Х2 см) на один мазок. Хранят в закрытой коробке.