Питательные среды

Патогенные бактерии, интересующие ветеринарных микробиологов, отлича­ются по способностям усваивать те или иные питательные вещества и размно­жаться в определенных условиях. Эти свойства микробов учитывают при изго­товлении сред для их выращивания, а нередко и для дифференциации.

Питательные среды по назначению разделяются на: общеупотребительные, пригодные для культивирования многих бактерий; дифференциальные, позволя­ющие различать бактерии разных видов и родов; элективные и среды обогаще­ния, благоприятствующие размножению бактерий определенных видов и подав­ляющие рост других микробов; специальные, наиболее оптимальные для выра­щивания бактерий тех или иных видов.

По консистенции различают питательные среды плотные, жидкие и полужидкие.

В настоящее время некоторые наиболее употребительные среды стандартизованы и выпускаются медицинской промышленностью в сухом виде. К числу та­ких сред, используемых в ветеринарных лабораториях, относятся:

агар питательный, рН 7,4-7,6;

агар питательный «Д» (дрожжевой); агар висмут-сульфит;

aгap с эозином и метиленовым синим (среда Левина);

бактоагар Плоскирева (бактоагар «Ж»);

бульон питательный;

среда Булира (МПБ с маннитом и нейтральротом);

среда Китта - Тарацци;

среда Эндо (фуксин-сульфитный агар);

среда для цветного ряда с индикатором ВР и глюкозой;

среда для цветного ряда с индикатором ВР и лактозой;

среда для цветного ряда с индикатором ВР и мальтозой;

среда для цветного ряда с индикатором ВР и маннитом;

среда для цветного ряда с индикатором ВР и сахарозой.

Кроме того, выпускаются дополнительные компоненты к питательным сре­дам: пептон бактериологический, желчь сухая и гидролизат лактальбумина в растворе Хенкса.

Однако большинство питательных сред обычно готовят на месте, включая и вышеперечисленные среды.

Приготовление сред из сухих препаратов. Их готовят согласно указаниям на этикетках банок. Навеску сухой питательной среды всыпают в стерильную колбу с неплотной ватной пробкой и вливают нужное количество дистиллирован­ной воды. Среду расплавляют и кипятят при постоянном помешивании на мед­ленном огне, защищенном асбестированной сеткой. Готовую среду, не подлежа­щую автоклавированию, остужают в теплой водяной бане до 50⁰С и тотчас разливают в стерильные чашки (пробирки) в боксе.

Поверхность стола, на котором различают агap, должна быть строго гори­зонтальной. В чашки наливают не менее 15 мл среды, ставят одна на другую, не допуская перекоса, и накрывают полотенцем. Когда агар застынет, чашки с наличием значительного конденсата ставят крышками книзу для подсушивания. В термостат с открытой вентиляцией.

Расплавленную среду, подлежащую автоклавированию, разливают в пробир­ки и колбы в нужных объемах и в тот же день стерилизуют при заданном ре­жиме. Вынутые из автоклава пробирки с агаром оставляют застывать в стол­биках или скашивают. Верхний край косяка должен быть не выше 2/3 пробирки, а нижний - не доходить на l см до ее дна. Когда надо скашивать много агара, то во избежание преждевременного его застывания пробирки держат в водяной бане при 50⁰С.

Расплавленный агар в колбах охлаждают до 50⁰С и разливают в чашки как описано выше, или хранят в застывшем виде. По мере надобности его рас­плавляют на водяной бане или текучим паром и разливают в соответствующую посуду. Длительно передерживать агар в жидком виде не следует, так как этого он хуже застывает.

Измерение концентрации водородных ионов (рН) колориметрическим способом по Михаэлису. Патогенные бактерии в большинстве своем могут нор­мально размножаться только в средах, имеющих нейтральную, слабокислую или слабощелочную реакцию. Для каждого микроба существуют свои известные гра­ницы этой реакции. Сухие рецептуры питательных сред готовят с учетом этих требований. Но при изготовлении сред на месте определение их реакции (рН) обязательно. С этой целью пользуются обычно методом Михаэлиса.

Набор Михаэлиса выпускают в двух вариантах, различающихся только раз­мерами. В наборе имеются:

а) три шкалы по девять цветных стандартов­ пробирок, содержащих растворы индикаторов: а-динитрофенола, паранитрофено­ла и метанитрофенола; на каждой пробирке указано название индикатора и ка­кому рН соответствует окраска его раствора;

б) флаконы с рабочими раствора­ми индикаторов;

в) компаратор Вальполя, представляющий собой колодку с тремя парами вертикальных гнезд, тремя сквозными смотровыми отверстиями 11 матовым стеклом на задней стороне колодки;

г) комплекты пробирок и пи­петок.

В микробиологии при изготовлении питательных сред пользуются почти иск­лючительно шкалой стандартов с метанитрофенолом, так как рН их от 6,8 до 8,4.

Порядок определения рН бесцветных растворов. В одну из пробирок большого набора наливают 6 мл испытуемого раствора и 1 мл рабочего раствора соответствующего Индикатора (если набор малый, то в пробирку наливают со­ответственно 0,6 мл и 0,1 мл), перемешивают и ставят пробирку в среднее гнез­до переднего ряда; по обеим сторонам ее помещают стандарты с тем же инди­катором, имеющие наиболее сходную по интенсивности окраску с испытуемым раствором. Просмотр ведут в проходящем свете у окна. Если цвет раствора оди­наков с одним из стандартов, то их рН равны; если же он является проме­жуточным между стандартами, допустим 7,0 и 7,2, то его рН принимают за Порядок определения рН бульона и других цветных сред. Передний ряд гнезд заполняют, как описано выше; в заднем ряду компаратора помещают по­средине пробирку с 7 мл дистиллированной воды, а по бокам - пробирки с та­ким же бульоном. Это делается для уравнивания условий опыта, поскольку из­меряется рН цветной жидкости.

Порядок определения рН агара. Испытуемый агар предварительно расплав­ляют; в ходе работы пробирки с агаром держат в бане при 50-55⁰С и поме­щают в компаратор только на время просмотра. Востальном поступают так же, как при определении рН бульона.

Если рН питательной среды в пробирке ниже заданного, то ее подщелачива­ют 0,4% -ным растворы едкого натра. Вносят измерительной пипеткой одну каплю его, перемешивают и проверяют результат. При необходимости щелочь добавляют, точно учитывая ее расход. Пипетку заранее надо выверить, т. е. узнать, какой объем имеет одна ее капля.

Ввиду того, что при стерилизации питательных сред их рН падает, при подщелачивании испытуемой пробы (а затем и всей среды) ее рН устанавлива­ют на 0,2-0,3 выше заданного конечного рН.

Количество щелочи, нужное для корректировки рН всего объема среды (раствора), узнают по формуле

Так как исправление рН всего объема проводит 10%-ным раствором едкого натра, то найденный объем раствора щелочи надо уменьшить в 25 раз.

Для приблизительного определения рН среды (раствора) можно пользовать­ся индикаторными бумажками «Фан» и другими, но при условии, что индикатор при смачивании бумажки не смывается со своей полоски, а ее показания про­верены с помощью набора Михаэлиса или потенциометра.