Прямые методы подсчета соматических клеток

К ним относят метод подсчета на стекле по Прэскотту-Бриду, камерные методы по Н.М.Хилькевичу, И.И.Архангельскому и др. в модификации В.И.Слободяника, подсчет с помощью электронного прибора «Фоссоматик», электронных счетчиков частиц: целлоскоп, «Культер-Каунтер», пикоскель, гемоцитометр кондуктометрический марки ГЦМК-3 и др.

Метод Прэскотта-Брида. Чистое предметное стекло кла­дут на лист бумаги, расчерченный на квадраты со стороной 1 см. Пробу молока тщательно перемешивают и с помощью микропипетки на­носят на 3-4 квадрата предметного отекла по 0,01 см³. Нанесенную каплю молока равномерно распределяют по площади квадрата стеклян­ной палочкой или препаровальной иглой. Мазок высушивают на возду­хе, фиксируют и одновременно обезжиривают нанесением сначала ме­тилового спирта на 10-15 мин, а затем спирт-эфирной смеси до высыхания. Окрашивают мазок рабочим раствором краски Романовского-Гимза (3-4 мл продажного раствора на 100 мл дистиллированной во­ды) методом подслаивания иди при вертикальном положении стекла в течение 20-30 мин. После окрашивания мазок промывают водой и вы­сушивают при комнатной температуре.

Подсчет соматических клеток ведут под микроскопом с иммерси­онным объективом. В каждом мазке просматривают 100 полей зрения. Подсчитанное число клеток умножают на коэффициент с учетом значе­ний объектива и окуляра и определяют их количество в 1 см³ моло­ка. Для выведения коэффициента с помощью объект-метра определяют диаметр поля зрения микроскопа и вычисляют площадь одного поля зрения по формуле πR². Затем вычисляют, сколько полей зрения мик­роскопа размещаются на площади 1 см². Полученный результат пере­водят на объем.

Пример: определение коэффициента пересчета при окуляре 7 и объективе 90. В поле зрения размещается 17 делений объект-метра. Величина одного деления - 0,01 мм. Диаметр поля зрения - 0,01 мм х 17 = 0,17мм, радиус - 0,085 мм. Площадь одного поля зрения -3,14 x 0,085² = 0,023 мм² или 0,00023 см². Площадь 100 полей зре­ния будет равна 0,00023 см² х 100 = 0,023 ом². На площади 1 см² таких участков будет: 1: 0,023 = 43,48. Взятый объем молока 0,01 см³ в 100 раз меньше 1 см³. Коэффициент в данном случае будет ра­вен 4348 (43,48х100).

За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.

Метод Н.М.Хилькевича. В пробирку наливают 0,4 мл разведенной краски Романовского-Гимза. (1 мл дистиллированной воды и 5 капель краски) и 20 мм³ исследуемого секрета вымени, получают разведение 1:20. Через 15-30 мин заполняют камеру Горяева. Лейкоциты подсчи­тывают в 1 большом квадрате и результат умножают на 5000.

Метод И.И.Архангельского и др. Сначала готовят солюбилизирующий раствор по следующей прописи. К 0,9% раствору натрия хлорида, содержащего 1% формалина и 12,5% этилового спирта, до­бавляют 1% солюбилизатора и нагревают при 60°С в течение 20 мин. В качестве солюбилизатора используют синтанол ДС-10 (оксиэтилированные жирные спирты фракции С₁₀-С₁₆ с 10 молями окиси этилена) или ПП-40 (полиоксиэтилированное производное пентола с 40 молями окиси этилена). После растворения солюбилизатора к раствору до­бавляют I% насыщенного спиртового раствора основного фуксина и фильтруют через бумажный фильтр. Краску к солюбилизирующему раст­вору добавляют непосредственно перед опытом.

Для подсчета соматических клеток в пробирку, содержащую 10 мл солюбилизирующего раствора с красителем, добавляют 0,1 мл тща­тельно перемешанного молока и прогревают в водяной бане при 80°С 30 мин. После остывания содержимое пробирки перемешивают и вносят каплю жидкости под покровное стекло счетной камеры: Горяева, Фукс-Розенталя или др. Подсчет клеток ведут под микроскопом (оку­ляр 7 или 10, объектив 8 или 10) во всей камере или в определен­ном ее объеме.

Расчет количества соматических клеток в 1 см³ проводят по формуле:

1000 х С х А

Х= --------------------------,

V

где Х - количество соматических клеток в 1 см³ молока;

А - количество подсчитанных соматических клеток;

С - разведение;

1000 - множитель, приводящий результат к объему 1см³;

V - объем, в котором подсчитаны клетки.

Метод И.И.Архангельского и др. в модификации В.И. Слободяника. Модификация метода И.И. Архангельского и др. заклю­чается в том, что насыщенный спиртовой раствор основного фуксина добавляют к солюбилизирующему раствору в количестве не I%, а 0,25%. и используют готовый красящий раствор в количествене 10 мл, а 5.

Это позволяет готовить полностью красящий раствор заблагов­ременно и использовать его в течение 15 дней после приготовления.

Расчеты ведут по вышеизложенной формуле с учетом сделанного разведения пробы молока.

Подсчет на приборе «Фоссоматик». Принцип работы прибора основан на том, что ядра соматических клеток молока окраши­вают флюорохромовыми красителями и равномерно распределяют обра­зец на вращающемся барабане. С помощью электронного устройства учитывается количество флюоресцирующих точек и полученный резуль­тат с помощью самописца фиксируется на ленте.

Производительность работы прибора составляет 180 проб молока в 1 ч.

Подсчет на электронных счетчиках частиц: целлоскопе «Культер-Каунтере», пикоскеле, гемоцитометре кондуктометрическом марки ГЦМК-3 и др. Принцип действия этих приборов основан на из­менении электрического сопротивления частиц, подлежащих подсчету. При прохождении соматических клеток через капиллярное отверстие скачкообразно повышается сопротивление, это служит импульсом, ко­торый регистрируется и подсчитывается электронным путем. Счетчики снабжены дискриминатором - устройством, которым подсчитывают только частицы определенной величины.