Общие положения. Лабораторный практикум

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА БИОСИНТЕЗ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ МИКРОБНЫМИ КУЛЬТУРАМИ

Лабораторный практикум

по технологии ферментных препаратов

Специальность 070100

Биотехнология

Киров 2008

Общие положения

Протеолитические ферменты используют в пищевой и легкой промышленности, общественном питании и сельском хозяйстве. Их добавляют в моющие средства, применяют при очистке сточных вод и т.д. Большой интерес представляет использование протеаз медицине при лечении сердечно-сосудистых заболеваний (особенно тромбозов).

Источниками протеолитических ферментов могут быть ткани и органы животных (поджелудочная железа, слизистая желудка), растения (плоды дынного дерева, ананасы, побеги и листья инжира), а также микроорганизмы (бактерии родов Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter, Escherichia, Sarcina, Serratia, актиномицеты рода Streptomyces, грибы родов Aspergillus, Penicillium идрожжи родов Candida, Saccharomyces и др.). Особенностью протеолитических ферментов животного происхождения является наличие зимогенов – неактивных предшественников (пепсин, трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы А и В, тромбин, плазмин и др.), а протеолитические ферменты микроорганизмов, в отличие от протеаз растительного и животного происхождения, обладают более широким спектром действия.

Протеолитические ферменты подразделяют на пептидазы КФ 3.4.11-15 (α -аминоацилпептидгидролазы, гидролазы пептидиламинокислот или ациламинокислот, дипептидгидролазы, дипептидилпептидгидролазы или пептидилдипептидгидролазы) и протеиназы КФ 3.4.21-24 (сериновые, тиоловые, кислые, содержащие атомы металлов в активных центрах, а также протеиназы с неустановленным механизмом действия). Субстратами протеолитических ферментов являются пептиды и белки (простые – протеины, которые состоят только из аминокислотных остатков и сложные – протеиды, в состав которых входят соединения небелковой природы). Протеиназы не имеют строгой субстратной специфичности – большинство их действует на все денатурированные и многие нативные белки.

В промышленности получают микробные ферментные препараты, содержащие комплекс протеиназ. Их суммарная активность определяется по соответствующему субстрату для которого ферментный препарат будет использоваться (желатина, растительный белок, коллаген, элластин, казеин и т.д.), по количеству образующегося в процессе гидролиза тирозина или триптофана.

Для производства протеолитических ферментов применяют поверхностный и глубинный способы культивирования.

При поверхностном культивировании в качестве продуцентов используют микроскопические грибы Aspergillus oryzae, Asp. flavus, Asp. terricola, Asp. niger, Asp. candidus, Rhizopus nigricans и др. Его проводят на пшеничных отрубях, которые могут быть обогащены солодовыми ростками, соевой мукой или белковым отстоем (отход пивоварения). Для синтеза протеаз необходима повышенная влажность среды (до 62-65%), что вызывает необходимость использовать в составе сред до 10-12% разрыхлителя – древесных опилок.

Глубинный способ применяют для культивирования большого количества бактериальных и грибных продуцентов протеолитических ферментов. Для производства нейтральных и щелочных протеиназ используют спороносные бактерии и актиномицеты, а кислых – микроскопические грибы.

Наиболее широко в нашей стране применяются штаммы бактерий, относящихся к роду Bacillus (B. subtilis и B. mesentericus). На основе которых выпускаются препараты протосубтилин и протомезентерин, которые используются в пищевой промышленности, сельском хозяйстве и производстве моющих средств.

Актиномицеты образуют внеклеточные протеиназы в значительных количествах, но редко используются в промышленности, т.к. одновременно с протеиназами они синтезируют антибиотики. Это исключает использование неочищенных препаратов в пищевой промышленности и в кормопроизводстве, но в то же время позволяет организовать одновременно на одном предприятии производство антибиотика из биомассы продуцента и протеолитических ферментов из культуральной жидкости. Примером может служить производство протеазы (проназы) продуцентом стрептомицина Streptomyces griseus в Японии. Проназа содержит от 11 до 13 протеаз (нейтральные и щелочные протеиназы, амино- и карбоксипептидазы). Препараты проназы содержат ферменты близкие по механизму действия на субстрат трипсину и химотрипсину и способны на 70-90% гидролизовать белок до аминокислот.

Активные протеолитические ферменты могут быть также получены на основе штаммов Str. rimosus и Str. fradiae. На основе Str. fradiae налажено производство препаратов кератиназы (протофрадин), которые используются в различных областях промышленности и медицине.

Микроскопические грибы образуют протеиназы, действующие в интервале рН от 4 до 10 (оптимальное значение – близкое к нейтральному). Большой интерес представляют продуценты видов: Asp. awamori, Asp. saitoi, Rh. javanicus, Rh. pygmaues и др., которые образуют протеазы с оптимальным действием при рН 2,0-2,5. В нашей стране разработаны технологии препаратов кислой протеиназы на основе глубинного культивирования штаммов Asp. awamori 200 и 78-2. Наибольший выход кислой протеиназы наблюдается на средах, содержащих 2% ржаной муки, 0,5% KH₂PO₄, смеси MgSO₄, FeSO₄ и ZnSO₄ (0,006%) и 0,1% казеина. Оптимальные условия рН действия препаратов на основе этой культуры составляют 1,8; 2,5; 3,0 и 3,5 при температурах: 40, 50, 60 и 70 °С соответственно. На основе грибных культур (Asp. saitoi, Rh. chinensis и Penicillium janthinellum) выпускаются кислые пепсиноподобные протеиназы, которые используются для гидролиза белка сои, хлебопечении и в медицине для улучшения пищеварения.

Протеолитические ферменты в основном являются внеклеточными ферментами. Считается, что регуляторное действие субстратов на биосинтез протеаз проявляется на уровне транскрипции по типу метаболитной репрессии. Синтез в клетках РНК контролируется либо соотношением ненагруженных и аминоацилированных тРНК (свободные тРНК являются репрессорами синтеза), либо действием гуанозинтетрафосфата (ppGpp), который образуется при аминокислотном голодании и подавляет синтез РНК. Считается, что низкое сродство специфических факторов инициации транскрипции или РНК-полимеразы к промотору генов внеклеточных протеаз приводит к тому, что в присутствии в среде в достаточном количестве аминокислот и других источников углерода, азота и серы в клетке осуществляется интесивный синтез нетранслируемых и иРНК для синтеза внутриклеточных белков, а частота транскрипции иРНК экзопротеаз незначительна. Этим объясняется низкий уровень образования внеклеточных протеаз в начале роста культуры при сбалансированном и богатом составе питательной среды. Истощение питательной среды в процессе роста культуры по одному или нескольким субстратам приводит к снижению уроня пула внутриклеточных аминокислот и приводит к снижению синтеза иРНК. В результате освобождаются факторы инициации транскрипции и увеличивается частота транскрипции генов экзопротеаз и соответственно их содержание в среде.

При наличии в среде белков экзопротеазы расщепляют их до аминокислот, которые поглощаются клеткой. Увеличение количества аминокислот в клетках может снова привести к репрессии синтеза протеаз.

При глубинном культивировании, как правило, используют комплексные питательные среды. Так, бактерии рода Bacillus (B. subtilis 103)выращивают на питательных средах, содержащих ферментативный гидролизат крахмала (до 3%), экстракт кукурузной муки (до 7%), соли калия, магния, кальция и аммония. рН среды вначале культивирования составляет 6,9, а в конце – 5,6. Протеолитическая активность культуральной жидкости в конце культивирования составляет до 2100 мкг тирозина на 1 см³ раствора. Грибные культуры выращивают на средах, содержащих ржаную муку (2%), казеин (0,1%), соли калия, магния, цинка и железа.

Выход протеаз у микроорганизмов зависит от условий культивирования и возраста культуры. При составлении оптимальных питательных сред для каждого продуцента изучаются его физиологические потребности в источниках азота, углерода и других соединениях. Оптимальные условия находят экспериментальным путем по максимальному накоплению протеолитических ферментов в опытных ферментациях, а также на основе математических методов планирования эксперимента. В целом можно отметить, что скорость биосинтеза протеаз контролируется скоростью роста продуцента.

Оптимальной для синтеза протеолитических ферментов является температура, при которой наблюдается максимальный рост продуцента. Микроорганизмы чувствительны к кислотности среды и при отклонении рН от оптимального значения резко снижают биосинтез ферментов. Грибы и дрожжеподобные микроорганизмы хорошо растут и синтезируют ферменты при рН от 3,8 до 5,6, а бактерии при рН, близким к нейтральному (при этом возможно преимущественное накопление в среде одного фермента при определенном значении рН). Так, при поверхностном культивировании, среды для производства большинства ферментов подкисляют до рН 4,5-5,0 для создания селективных условий, но при производстве протеолитических ферментов среда не подкисляется, т.к. кислая среда ингибируют их синтез (оптимальное значение рН – 5,6-6,3).

Аэрирование проводят для снабжения культуры воздухом и удаления газообразных продуктов обмена. В случае поверхностного культивирования аэрация служит и для отвода тепла, выделяющегося при метаболизме (на стадии активного роста культуры выделяется до 4000 кДж/кг среды). Поэтому расход воздуха при поверхностном культивировании превышает физиологическую потребность микроорганизмов.

При глубинном культивировании (большинство продуцентов аэробы) увеличение степени аэрирования в определенных пределах приводит к интенсификации процесса биосинтеза ферментов. Кроме того, при разной степени аэрации один и тот же вид микроорганизмов способен накапливать разные ферменты. Так, например, гриб Trichoderma longibrachiatum при степени аэрации 25 мг О₂/дм³ ▪мин накапливает в культуральной жидкости в основном амилазы, при 20 – целлюлазы, а протеолитические ферменты – при 15-18 мг О₂/дм³ ▪мин.

Длительность культивирования зависит от большого числа факторов: объёма посевного материала, состава питательной среды, аэрирования, способа культивирования, физиологических особенностей продуцента и т.д. Так, например, максимальное накопление амилолитических ферментов при глубинном культивировании B. mesentericus происходит через 36 ч, Endomycopsis sp. – через60 ч, Asp. orysae 1414– 80 ч,а Asp. awamori – 150 ч. При объёме посевного материала 3% длительность культивирования Asp. orysae 1414составляет 40 ч, при объёме посевного материала 5% длительность ферментации – 30 ч, а при 10% посевного материала длительность – 24 ч.

Возраст посевного материала также влияет на накопление ферментов. Так, для Asp. orysae 1414 при объёме посевного материала 3% и его возрасте 24 ч выход липаз максимален (100%), при возрасте 16 ч он составляет 80%, при возрасте 32 ч – 90%, а при 48 ч – 30% от максимально возможного.

Содержание сухих веществ в питательной среде в зависимости от продуцента может составлять от 6 до 20%. Применение дробной подачи субстрата также позволяет снизить время культивирования (осмотический фактор). Так, например, использование дробной подпитки при синтезе α -глюканазы B. subtilis 402 позволяет сократить время ферментации до 20 ч (в контроле – 28 ч) и получить культуральную жидкость с активностью фермента 85 ед/см³ (в контроле – 60 ед/см³).

При использовании в составе питательных сред неорганических форм азота (соли аммония и нитраты) особое внимание обращают на изменение рН среды в результате избирательного поглощения катиона (подкисление) или аниона (подщелачивание) питательной среды, что вызывает изменение биосинтетической активности продуцента. Например, использование в составе питательной среды для культивирования B. subtilis 103 NH₄NO₃ (3%) вызывает накопление в среде ионов NO₃^¯ и её подкисление (рН в начале культивирования – 6,9, в конце – 4,45). Хотя рост культуры в этих условиях продолжается (концентрация биомассы – 0,26 г/100 см³), но биосинтез протеиназ прекращается. При использовании в качестве источника азота (NH₄)₂SO₄ и (NH₄)₂HPO₄ в количестве 3% среда в конце культивирования подкисляется в меньшей степени 4,80 и 5,60 соответственно. Протеолитическая активность в этих условиях составляет 66,8 и 100,2 мкг тирозина на 1 см³ культуральной жидкости, а конечная концентрация в ней биомассы составляет 0,40 и 0,80 г/100 см³ соответственно. Использование пептона или кукурузного экстракта позволяет повысить протеолитическую активность культуральной жидкости до 187,7 и 200 мкг тирозина, соответственно. Концентрация биомассы в обоих случаях – 1,00 г/100 см³, а конечные значения рН среды повышаются до 7,5 и 7,6. Применение (NH₄)₂HPO₄ (1,2%) и кукурузного экстракта (0,8%) при культивировании B. subtilis 103позволяет увеличить протеолитическую активность культуральной жидкости по тирозину до 1300 ед/см³ .

Фосфор в составе питательных сред используется преимущественно в виде неорганических солей (наибольший выход протеолитических ферментов наблюдается при одновременном использовании неорганических и органических форм фосфора). Особенно интенсивно фосфор потребляется культурами микроорганизмов в фазу логарифмического роста (более 90% от его исходного содержания).

Многие промышленные штаммы-продуценты ферментов являются ауксотрофами по витаминам группы В (В₁, В₂, В₃, В₅ и В₆). Источниками витаминов являются гидролизаты и автолизаты кормовых дрожжей, кукурузный экстракт, отвары муки, выжимки плодов и овощей.

Наличие или отсутствие в питательной среде отдельных микроэлементов также оказывает влияние на синтез ферментов. Так, ионы меди, цинка и марганца ингибируют биосинтез амилаз, а соли натрия, кобальта, кальция и магния напротив, стимулируют его. Цинк стимулирует синтез протеиназ у бактерий, актиномицетов и грибов, за счет интенсификации углеводного обмена, синтеза аминокислот и белков. Кроме того, он является кофактором ряда протеиназ.

В зависимости от концентрации, одни и те же металлы могут быть стимуляторами или ингибиторами синтеза ферментов. Например, железо, цинк и медь в концентрации 0,1-0,2▪10^-6 М стимулируют, а в концентрации 0,5▪10^-5 М тормозят синтез ферментов. Ингибирующее действие металлов может быть снято добавлением к синтетическим средам белков, экстрактов растений и т.д.

Таким образом, для роста и биосинтеза протеолитических ферментов необходимо, чтобы питательная среда имела определённое значение рН, содержала источники С, N и Р в оптимальных соотношениях, витамины, ростовые факторы макро- и микроэлементы. Кроме того, на выход протеаз оказывают влияние возраст и объём посевного материала, а также степень аэрации и температура в течение всего процесса ферментации.