double arrow

Используемые методы анализа


2.3.1. Определение концентрации биомассы продуцента

Мицелий гриба Asp. niger при культивировании на качалке образует глубинные колонии, имеющие форму шариков, или кашеобразную массу из обрывков гиф. Культуральная жидкость должна оставаться прозрачной в течение всего периода культивирования. Помутнение раствора свидетельствует о бактериальном загрязнении среды (в этом случае опыт повторяют со свежими питательными средами и посевным материалом).

Количество биомассы гриба Asp. niger определяют по массе сухого мицелия. Для этого из глубинной культуры гриба с помощью пипетки с широким носиком отбирают 5 см3 пробы и отфильтровывают через заранее высушенный и взвешенный бумажный фильтр. Мицелий на фильтре трижды промывают от солей 5 см3 0,1 н раствора HСl, тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу при 80 °С до постоянной массы. По разности масс фильтра с мицеллием и без него определяют массу сухого мицелия в 5 см3 культуральной жидкости и пересчитывают её на 1 дм3 раствора.

Концентрацию бактериальной биомассы в культуральной жидкости определяют по показателю оптической плотности растворов. В определённых пределах количество рассеянного света пропорционально отношению размера клеток к длине волны падающего света. Данным методом можно определить концентрацию биомассы для культур микроорганизмов, развитие которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, а также образованием плёнок, мицелия или других скоплений. Питательная среда при этом должна быть оптически прозрачной. Если помутнение среды вызвано выпадением в осадок солей (фосфатов), то перед измерением оптической плотности растворов их подкисляют хлористоводородной кислотой.

Для определения количества клеток бактерий B. subtilis в питательной среде (культуральной жидкости)отбирают стерильной пипеткой из колбы 5 см3 культуральной жидкости, переносят её в пробирку и добавляют 1-2 капли конц. хлористоводородной кислоты. Оптическую плотность растворов определяют в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны света 540 нм. В качестве раствора сравнения используют исходную питательную среду.

Концентрацию биомассы бактерий (г/дм3) определяют по калибровочному графику, имеющемуся в лаборатории.

Для каждой пробы культуры гриба и бактерий проводят по два параллельных определения количества биомассы.

2.3.2. Определение сульфитного числа

Степень аэрации зависит от растворимости кислорода в питательной среде, температуры культивирования, вязкости среды и конструктивных особенностей ферментатора. Её оценивают по сульфитному числу. Метод основан на определении скорости окисления сульфита в сульфат в присутствии ионов меди как катализатора. Не окисленный сульфит натрия связывают избыточным количеством 0,1 н раствора йода, который оттитровывают 0,1 н раствором тиосульфата натрия. Таким образом, определяют какое количество сульфита окисляется кислородом воздуха за единицу времени. Метод не характеризует поступление кислорода в среду для культивирования микроорганизмов, а дает сравнительные данные о скорости поглощения кислорода раствором сульфита в условиях (температура, режим перемешивания и т.д.), аналогичных опытным. Результат получается несколько завышенным по-сравнению с культурами микроорганизмов.

Для того, чтобы определить необходимый для анализа объём раствора йода (а) к 5 см3 раствора сульфита натрия приливают из бюретки 0,1 н раствор йода до появления светло-коричневой окраски. Затем в колбу вместимостью 250 см3 приливают найденный объём (а) 0,1 н раствора йода и титруют его 0,1 н раствором тиосульфата натрия до появления соломенно-желтой окраски. К раствору добавляют 1-2 капли крахмала и продолжают титрование до обесцвечивания раствора. На титрование должно израсходоваться около 30-40 см3 0,1 н раствора тиосульфата натрия.

Для определения сульфитного числа в колбу для культивирования микроорганизмов приливают 25, 50 и 75 см3 раствора сульфита натрия, добавляют 0,05 г CuSO4▪5H2O (из расчета на 50 см3 раствора), включают качалку (200-230 об/мин) и с интервалом 5 мин отбирают по 5 см3 раствора в конические колбы вместимостью 250 см3, в которые предварительно приливают по а см3 0,1 н раствора I2. Содержимое колб титруют 0,1 н раствором тиосульфата натрия. Для каждого из выбранных объёмов растворов сульфита натрия проводят по 2-3 последовательных замера.

2.3.3. Определение рН

Питательную среду (культуральную жидкость) центрифугируют или фильтруют через бумажный фильтр для отделения взвешенных частиц и/или биомассы. Наливают в химический стаканчик 50 см3 фильтрата или фугата и определяют рН раствора с помощью рН-метра.

Для каждой пробы проводят по два параллельных определения.

2.3.4. Определение содержания нитрат-ионов (по Гранвалю-Лажу)

Метод основан на реакции между нитратами и фенолдисульфоновой кислотой с образованием нитропроизводных фенола, окрашенных в желтый цвет. Определению мешают хлориды, которые связывают добавлением раствора сернокислого серебра (1 см3 раствора способен связать 1 мг Cl-).

Для приготовления основного раствора нитрата калия 0,7218 г KNO3, высушенного до постоянной массы при 105±2 °С растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 дм3 и добавляют 1 см3 хлороформа (1 см3 раствора содержит 100 мкг нитратного азота).

Для приготовления рабочего стандартного раствора нитрата калия 50 см3 основного растора выпаривают досуха на водяной бане, к сухому остатку добавляют 2 см3 фенолдисульфоновой кислоты и растирают стеклянной палочкой до полного смешения. Затем добавляют 3-5 см3 дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу на 500 см3 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой (1 см3 раствора содержит 10 мкг нитратного азота).

Для построения калибровочной кривой в мерные колбы вместимостью 50 см3 вносят 0,0; 1,0; 3,0; 5,0; 10,0; 20,0 и 30,0 см3 исходного стандартного раствора нитрата калия (1см3 раствора содержит 10 мкг N). В каждую колбу приливают 2 см3 раствора фенолдисульфоновой кислоты и 5-6 см3 25%-ного раствора аммиака до максимального развития окраски. Объём раствора в колбах доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Оптическую плотность растворов определяют на спектрофотометре при 480 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют пробу, в которую не вносится раствор KNO3. По полученным результатам строят калибровочный график, откладывая на оси ординат значения оптической плотности растворов, а на оси абсцисс соответствующие им значения концентрации азота в мкг/см3.

К 10-100 см3 фильтрата или фугата питательной среды (культуральной жидкости), добавляют рассчитанное количество раствора сернокислого серебра и выпаривают раствор досуха в фарфоровой чашке на водяной бане (осадок хлорида серебра отфильтровывают в том случае, когда содержание Cl- в определяемом объёме превышает 15 мг). Содержание нитратного азота в отобранной пробе не должно превышать 0,6 мг (при необходимости её разбавляют дистиллированной водой).

Затем к сухому остатку приливают 2 см3 раствора фенолдисульфоновой кислоты, растирают стеклянной палочкой до растворения осадка, добавляют 20 см3 дистиллированной воды и 5-6 см3 25%-ного раствора аммиака до максимального развития окраски. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и измеряют оптическую плотность раствора в тех же условиях, как при построении калибровочной кривой.

Для каждой пробы проводят по два параллельных определения.

2.3.5. Определение содержания ионов аммония

Метод предназначен для определения аммонийного азота в растворах питательных сред и культуральной жидкости. Он основан на спектрофотометрическом определении йодистого меркуроаммония, образующегося при взаимодействии ионов аммония с реактивом Несслера в щелочной среде. Определению мешают ионы кальция, которые осаждают прибавлением раствора сегнетовой соли.

0,9428 г предварительно высушенного при 105±2 °С до постоянной массы (NH4)2SO4 растворяют в мерной колбе на 1 дм3 (в 1 см3 раствора содержится 200 мкг азота). Из исходного стандартного раствора готовят рабочие стандартные растворы, содержащие 10-100 мкг/см3 азота.

В пробирки с пришлифованными пробками вносят 1 см3 исходного стандартного раствора, приливают 15 см3 дистиллированной воды и 1 см3 реактива Несслера. Пробирки закрывают пробками, перемешивают и измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при 440 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 16 см3 дистиллированной воды и 1 см3 реактива Несслера. По полученным результатам строят калибровочный график, откладывая на оси ординат значения оптической плотности растворов, а на оси абсцисс соответствующие им значения концентрации азота в мкг/см3.

Отбирают 1 см3 фильтрата или фугата пробы в пробирку с пришлифованной пробкой, приливают 15 см3 дистиллированной воды, 1 см3 реактива Несслера, перемешивают. Пробы должны содержать не более 100 мкг/дм3 азота, поэтому при необходимости их разбавляют дистиллированной водой. Если после прибавления к исследуемому раствору реактива Несслера появляется опалесценция, определение повторяют, добавив к 1 см3 исследуемого раствора 1 см3 раствора сегнетовой соли, 14 см3 дистиллированной воды и 1 см3 реактива Несслера. Оптическую плотность полученного раствора определяют на спектрофотометре при 440 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный аналогичным образом, но содержащий дистиллированную воду вместо пробы. Определение содержания азота проводят по калибровочному графику.

Для каждой пробы проводят по два параллельных определения.

2.3.6. Определение содержания фосфат-ионов

Метод основан на спектрофотометрическом определении фосфорномолибденовой кислоты, образующейся при взаимодействии фосфат-ионов с молибдованадатным реактивом.

0,7165 г KH2PO4 растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 дм3, добавляют 2 см3 хлороформа. Для приготовления рабочего стандартного раствора фосфорнокислого калия 2 см3 исходного раствора переносят в колбу вместимостью 1 дм3 и доводят до метки дистиллированной водой.

Для построения калибровочного графика в мерные колбы вместимостью 50 см3 вносят пипеткой 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 и 20,0 см3 рабочего стандартного раствора фосфорнокислого калия (1 см3 раствора содержит 1 мкг PO43-) и доводят объём раствора в них до метки дистиллированной водой. Содержание PO43- в 1 дм3 раствора будет соответственно равно 10; 20; 40; 100; 200 и 400 мкг. В каждую колбу добавляют 1 см3 раствора молибденовокислого аммония, перемешивают и через 5 мин вносят 0,1 см3 рабочего раствора двухлористого олова (2,5 см3 основного раствора двухлористого олова разбавляют до объёма 10 см3 дистиллированной водой). Интенсивность окраски растворов определяют на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны света 690-720 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный аналогичным образом, но без внесения стандарного раствора фосфорнокислого калия. По полученным данным строят калибровочный график, откладывая на оси ординат значение оптической плотности раствора, а на оси абсцисс соответствующую концентрацию фосфора в мкг/дм3.

Для определения фосфора в опытных пробах отбирают 1 см3 фильтрата или фугата культуральной жидкости в мерную колбу вместимостью 50 см3 и добавляют реактивы в количестве и порядке, указанном при построении калибровочного графика и определяют оптическую плотность растворов.

Пробы должны содержать не более 400 мкг/дм3 азота, поэтому при необходимости их разбавляют дистиллированной водой. Содержание фосфора в пробах находят по калибровочному графику.

Для каждой пробы проводят по два параллельных определения.

2.3.7. Определение протеолитической активности

Протеолитическую активность культуральной жидкости находят по методу Ансона, который основан на определении количества тирозина (триптофана), образующегося при гидролизе казеина протеолитическими ферментами по реакции с реактивом Фолина. Интенсивность окраски раствора зависит от количества тирозина (триптофана). Оптическую плотность растворов определяют на спектрофотометре. Для построения калибровочной кривой готовят стандартные растворы, содержащие 10, 20, 30, 40 и 50 мкг/см3 тирозина (триптофана) из исходного раствора, содержащего 100 мкг/см3.

В пробирки приливают 1 см3 стандартного рабочего раствора, 4 см3 раствора С и выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Затем в пробирку приливают 1 см3 реактива Фолина, раствор перемешивают и оставляют на 30-40 мин при комнатной температуре для развития окраски. Оптическую плотность растворов определяют на спектрофотометре при 650-677 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор приготовленный аналогичным образом, но содержащий 1 см3 дистиллированной воды вместо пробы.

В пробирку отбирают 1 см3 фильтрата или фугата пробы, помещают её на водяную баню и выдерживают при 37 °С в течение 10 мин. Затем в пробирку приливают 2 см3 1%-ного раствора казеина и выдерживают смесь при 37 °С в течение 10 мин (время отмечают по секундомеру). Пробирку вынимают из водяной бани и приливают 5 см3 5%-ного раствора ТХУ для остановки реакции и осаждения белка (казеина и протеолитических ферментов). Раствор фильтруют через бумажный фильтр. В полученном фильтрате (1 см3) определяют содержание тирозина (триптофана).

Для определения поправки на тирозин (триптофан), содержащийся в культуральной жидкости к 1 см3 пробы приливают 5 см3 5%-ного раствора ТХУ и затем 2 см3 1%-ного раствора казеина. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и 1 см3 фильтрата отбирают для определения тирозина (триптофана). В качестве раствора сравнения используют контрольный раствор. Его готовят, применяя те же реактивы, но вместо исследуемого раствора используют 1 см3 дистиллированной воды. При высокой протеолитической активности культуральную жидкость предварительно разбавляют.

Для каждой пробы проводят по два параллельных определения.


Сейчас читают про: